New England Biolabs, M0495L, ADN polimerasa Taq de arranque en caliente

El estándar de la industria con rendimiento de inicio en caliente Categorías relacionadas Taq, ADN polimerasa Aplicaciones PCR de colonias, PCR multiplex, PCR especializada, Especificación Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima que incorporará 15 nmol de dNTP en material insoluble en ácido en 30 minutos a 75 °C. Condiciones de reacción 1X Paquete de tampón de reacción Taq estándar 1X Paquete de tampón de reacción Taq estándar 10 mM Tris-HCl 50 mM KCl 1,5 mM MgCl2 (pH 8,3 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 10 mM Tris-HCl 100 mM KCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 50 % glicerol 1X estabilizadores pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor Sin unidad Condiciones del ensayo 1X tampón de reacción ThermoPol®, 200 µM dNTP que incluyen [3H]-dTTP y 15 nM de ADN M13 cebado. Preguntas frecuentes P: ¿Qué extremos tendrán mis productos de PCR? A: PRODUCTOS DE POLIMERASA DE APLICACIÓN PRODUCTO PCR EXTREMOS PCR de alta fidelidad Polimerasas Q5® Blunt Polimerasas Phusion® Blunt PCR de rutina y especial Polimerasas OneTaq® 3'A/blunt Polimerasas Taq 3'A Polimerasas LongAmp® 3'A/blunt Hemo KlenTaq Polimerasa 3'A Amplificación isotérmica Polimerasas Bst 3'A Polimerasa Bsu 3'A Polimerasa phi29 Blunt Manipulación de ADN Polimerasa de ADN T7 Blunt ADN polimerasa I de E. coli Blunt ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) Fragmento Klenow romo (3'-5' exo-) 3'A Polimerasa de ADN T4 Blunt Vent® Polimerasa Blunt Vent® (exo-) Polimerasa 3'A Polimerasa Deep Vent® Blunt Deep Vent® (exo-) Polimerasa 3'A Para más información Para obtener más información sobre nuestras polimerasas, incluidas las actividades y aplicaciones de las exonucleasas, visite nuestra Tabla de selección de ADN polimerasa. Más información Para obtener más información sobre la actividad de las exonucleasas, consulte estas preguntas frecuentes. ¿Por qué algunas polimerasas se embotan y otras añaden un nucleótido? Las polimerasas que poseen actividad de corrección (exonucleasa 3'-5'), como Q5, Phusion y Deep Vent, añadirán un nucleótido sin plantilla a los extremos 3' de los fragmentos de ADN extendidos, pero la actividad de la exonucleasa lo elimina posteriormente. Otras polimerasas que carecen de actividad de exonucleasa 3'-5' (como Taq y las polimerasas basadas en Taq) añadirán un nucleótido adicional a los extremos 3' (predominantemente, pero no exclusivamente, dA) y dejarán intacto el saliente sin plantilla. Por eso es importante saber qué polimerasa utilizar al realizar la clonación de extremos romos o T/A. Las ADN polimerasas OneTaq y LongAmp Taq son mezclas optimizadas de las ADN polimerasas Taq (una polimerasa de la Familia A) y Deep Vent (una polimerasa de la Familia B). La actividad intrínseca de la polimerasa de Taq añade un 3'A sin plantilla, mientras que la actividad de la exonucleasa 3'–5' de Deep Vent aumenta la fidelidad y robustez de Taq, pero también opaca los productos de PCR. Es por esto que estos productos producen una mezcla de extremos de ADN. Sin embargo, la mayoría de los extremos tendrán un saliente 3'A. P: ¿Qué son las polimerasas Hot Start y WarmStart® y cuándo debería usarlas? R: Al configurar reacciones a temperatura ambiente fuera del hielo Cuando se observa una amplificación no específica ¿Qué significa Hot Start/Warm Start? Nuestras polimerasas Hot Start y WarmStart utilizan aptámeros que inhiben la actividad enzimática a temperatura ambiente, lo que desalienta la formación de productos no específicos. La presencia de estos aptámeros no altera la función enzimática central. La diferencia entre Hot Start y WarmStart radica en que las enzimas Hot Start son termófilas, mientras que las WarmStart® son mesófilas. El rango termodinámico de los aptámeros para las enzimas Hot Start y WarmStart es en gran medida similar. Los aptámeros son oligonucleótidos modificados que se unen a una molécula diana específica mediante interacciones no covalentes e incluyen modificaciones específicas de nucleobases que pueden mejorar los perfiles de inhibición o reducir los efectos secundarios no deseados. La ventaja de la inhibición basada en aptámeros sobre otras tecnologías Hot Start (como los anticuerpos) es que no requieren un paso de activación y se unen de forma reversible, dependiendo de la temperatura. NEB ofrece polimerasas con aptámeros para PCR de rutina, PCR de alta fidelidad, amplificación isotérmica y transcripción inversa. Estos aptámeros pueden dirigirse a diferentes funciones enzimáticas para diferentes polimerasas. Más información. ¿Por qué se llama "Hot Start"? Al igual que muchas ADN polimerasas de la Familia A sin corrección de errores, la Taq Polimerasa posee la capacidad de añadir bases al extremo del ADNmc de forma independiente del molde, incluso a temperatura ambiente, y puede resultar en la adición de bases no específicas a los extremos de los cebadores de ADN en la reacción, lo que permite la hibridación inespecífica y reduce la especificidad general de la reacción. Por el contrario, a temperaturas más altas, la unión no específica se reduce a medida que la hibridación se vuelve más rigurosa. Los primeros métodos para mitigar la actividad no deseada a baja temperatura se centraban en la exclusión de componentes clave de la reacción hasta que se aumentaba la temperatura de reacción, que luego se podían añadir a la mezcla, desencadenando la reacción en condiciones más restrictivas de alta temperatura. Lea nuestro artículo destacado, "Uso de aptámeros para controlar las actividades enzimáticas: Hot Start Taq y más allá", para ver datos que comparan la formación de productos para enzimas con y sin inhibición de la actividad basada en aptámeros. P: ¿Cómo debo determinar la temperatura de hibridación adecuada para mi reacción? R: La temperatura de hibridación óptima (Ta) para un par de cebadores se puede determinar empíricamente mediante una PCR en gradiente. Utilice la calculadora de Tm de NEB para determinar la temperatura de annealing inicial para su par de cebadores y la polimerasa/tampón NEB que se utilizará. A diferencia de otras calculadoras, la calculadora de Tm de NEB considera los componentes del tampón que afectan las temperaturas de fusión y las observaciones empíricas al calcular la temperatura de annealing óptima. Otras calculadoras en línea pueden subestimar la mejor temperatura de annealing para la polimerasa Q5. Para obtener más información sobre el uso de una única temperatura de annealing (es decir, "universal"), consulte nuestra nota de aplicación: Temperatura de annealing universal en PCR y su impacto en los resultados de amplificación. Más información. Una PCR eficiente es un equilibrio dinámico de sustancias químicas y reactivos que promueven la interacción de un cebador específico con su complemento en el molde a la temperatura de annealing seleccionada. Si bien las temperaturas de annealing son valores constantes seleccionados por el científico, las temperaturas de fusión entre cada cebador y el molde pueden variar de un amplicón a otro. Definiciones. Nota: esta sección trata específicamente sobre el annealing de un cebador de oligonucleótidos a un molde de ADN. Durante el paso de desnaturalización de la PCR, la alta temperatura separa el dsADN molde en ssADN, revelando secuencias de nucleótidos complejas que permiten la hibridación (unión, hibridación, asociación) de un cebador oligonucleótido monocatenario complementario a una temperatura más baja. La temperatura de hibridación (TA) es la temperatura utilizada durante el paso de hibridación del cebador de una PCR, que depende de la temperatura de fusión del cebador. La temperatura de fusión (TM) de un cebador es la temperatura a la que el 50% del cebador está unido a su complemento perfecto y el 50% está libre en solución debido a la disociación ("fusión") de su complemento. ¿Por qué es importante usar la temperatura de hibridación correcta para una PCR exitosa? La temperatura de hibridación de una reacción suele ser inferior a la temperatura de fusión para garantizar la hibridación del cebador con el molde. Si la temperatura de hibridación es demasiado alta, el cebador no se hibridará con el molde y la amplificación no continuará. Si la temperatura de annealing es demasiado baja, puede ocurrir una unión no específica del cebador(es) a la plantilla o entre sí (dímeros de cebador), causando: Mayor probabilidad de formación de producto no específico. Disminución de la formación del producto deseado debido a condiciones de reacción ineficientes. Reactivos de PCR que influyen en la temperatura de fusión del cebador y la temperatura de annealing de la reacción Las temperaturas de fusión no son valores constantes en una PCR y están influenciadas por varios factores: Longitud del cebador y proporción de guanina y citosina en relación con adenina y timina (% contenido de GC) Dicta la cantidad de enlaces de hidrógeno entre el cebador y su complemento. Cuanto mayor sea el enlace de hidrógeno (mayor Tm) de un cebador a su plantilla, más energía se necesita para romper esos enlaces (mayor temperatura). Concentración del cebador La temperatura de fusión de los cebadores en una PCR está determinada por las especies de ADN en exceso molar, que deberían ser los cebadores. Magnesio y dNTPs La concentración libre de iones magnesio [Mg2+] determina la temperatura de fusión de un dúplex de ADN, pero el magnesio puede ser secuestrado por los reactantes y productos de la PCR. La carga positiva del magnesio quela los fosfatos cargados negativamente de los dNTPs, cebadores y ssADN. La reducción de las repulsiones electrostáticas (entre el cebador y los fosfatos del ssADN) aumenta la concentración del cebador de cationes monovalentes (Na+, K+). Los cationes monovalentes apoyan la estabilidad del dúplex de ADN, de forma similar a los iones magnesio. Los cationes monovalentes y los iones magnesio compiten por la unión al ADN. El aumento de la concentración de cationes monovalentes disminuye la unión del magnesio al ADN. P: ¿Cuál debería ser la concentración final del cebador en mi PCR? A: PRODUCTOS DE POLIMERASA CONCENTRACIÓN FINAL DE CEBADOR RECOMENDADA (CADA UNO) RANGO DE CONCENTRACIÓN FINAL DE CEBADOR (CADA UNO) Polimerasas Q5® 500 nM 200-1000 nM Polimerasas Phusion® 500 nM 200-1000 nM Polimerasas OneTaq® 200 nM 50-1000 nM Polimerasas Taq 200 nM 50-1000 nM Hemo KlenTaq 300 nM 50-1000 nM Polimerasas LongAmp® 400 nM 50-1000 nM Recomendamos una concentración final de cebador de 500 nM cuando se utilizan polimerasas Q5 y ​​Phusion debido a su alta actividad de exonucleasa 3´-5´. Recomendamos una concentración final de cebador de 200 nM al usar polimerasas basadas en Taq, incluyendo OneTaq y EpiMark®. Consulte los protocolos específicos en las páginas de productos para obtener detalles sobre las recomendaciones de rango. Más información Las polimerasas de la familia B de Archaeal, como Q5 y ​​Phusion, poseen una fuerte actividad de exonucleasa 3'-5', que puede digerir nucleótidos en el extremo 3' de los cebadores y aumentar la probabilidad de amplificación no específica. En relación con las polimerasas de la familia A como Taq y OneTaq, una mayor concentración final de cebador supera estos efectos y promueve la formación de productos específicos. Generalmente, la PCR eficiente requiere proporciones óptimas de magnesio, otros iones y cebadores para promover la especificidad al estabilizar las cargas negativas en la cadena principal de fosfato. Si bien la composición de las ADN polimerasas Q5 y ​​Phusion es propietaria, sus tampones están optimizados para usar una concentración final de cebador de 500 nM. P: ¿Cuáles son las propiedades de esta polimerasa (fidelidad, extremos del producto, amplicón máximo, incorporación de bases modificadas, etc.)? A: FIDELIDAD DE LOS PRODUCTOS DE POLIMERASA* TASA DE ERROR EXTREMOS DEL PRODUCTO LONGITUD MÁXIMA DEL PRODUCTO** TEMPERATURA DE EXTENSIÓN INCORPORACIÓN DE NUCLEÓTIDOS MODIFICADOS*** INCORPORACIÓN DE URACILO 5´-3´ EXONUCLEASE 3´-5´ (CORRECCIÓN DE PRUEBAS) EXONUCLEASE Q5 Polimerasas 280X <0,44 x 10-6 Blunt 20 kb simple, 10 kb complejo 72 °C 5 mC, 5 hmC, 6 mA No (excepto Q5U) - ++++ Phusion Polimerasas 39-50X 0,44 x 10-6 Blunt 20 kb simple, 10 kb complejo 72 °C 5 mC, 5 hmC No - ++++ OneTaq Polimerasas 2X <140 x 10-6 3´A/romo 6 kb 68 °C 5 mC, 5 hmC, biotina, DIG Sí + ++ Taq Polimerasas 1X 2,85 x 10^-4 3´A 5 kb 68 °C 5 mC, 5 hmC, biotina, DIG Sí + - Hemo KlenTaq nt nt 3´A 2 kb 68 °C Sí No - LongAmp® Polimerasas 2X 3´A/romo 30 kb 65 °C No Sí ++ *Fidelidad relativa a la ADN polimerasa Taq. Seguimos investigando ensayos para caracterizar la tasa de error muy baja de Q5 para garantizar que presentamos los datos de fidelidad más precisos posibles (Potapov, V y Ong, JL (2017) PloS ONE, 12(1): e0169774). **Las plantillas simples incluyen ADN genómico plasmídico, viral y de E. coli. Las plantillas complejas incluyen ADN genómico y ADNc de plantas, humanos y otros mamíferos. *** Para más información, contacte con el soporte técnico en info@neb.com. Para más información sobre las propiedades que le ayudarán a seleccionar una polimerasa para su aplicación, consulte nuestra Tabla de Selección de ADN Polimerasas. Más información Fidelidad y tasa de error. La fidelidad de una ADN polimerasa se define por su capacidad para replicar con precisión una plantilla, mientras que la tasa de error es la tasa de incorporación errónea de un nucleótido incorrectamente emparejado. La fidelidad es importante para aplicaciones en las que la secuencia de ADN debe ser correcta después de la amplificación. Para más información sobre cómo se mide la fidelidad, haga clic aquí. Extremos de producto y actividad de exonucleasa. Consulte la sección "Más información" en nuestras preguntas frecuentes sobre extremos de producto de PCR y nuestras preguntas frecuentes sobre la actividad de exonucleasa para ADN polimerasas. P: ¿Cuáles son los requisitos de estabilidad y almacenamiento para las ADN polimerasas Taq y OneTaq de NEB? A: Los productos Taq y OneTaq que se listan a continuación deben almacenarse a -20 °C y tienen una vida útil de 24 meses: M0267 Taq ADN polimerasa con tampón ThermoPol® M0270 Taq 2X Master Mix M0271 Quick Load Taq 2X MM M0271 Quick-Load® Taq 2X Master Mix M0273 Taq ADN polimerasa con tampón Taq estándar M0284 Multiplex PCR 5X Master Mix M0285 Taq 5X Master Mix M0320 Taq ADN polimerasa con tampón Taq estándar (sin Mg) M0495 Taq ADN polimerasa de inicio en caliente M0496 Taq 2X Master Mix M0480 OneTaq® ADN polimerasa M0481 OneTaq® ADN polimerasa de inicio en caliente M0482 OneTaq® 2X Master Mix con tampón estándar M0484 OneTaq® Hot Start P: ¿Este producto Taq DNA Polymerase es compatible con otros tampones NEB? A: Nombre del producto Polimerasa TaqDNA de inicio en caliente Polimerasa TaqDNA con tampón estándar Polimerasa TaqDNA con tampón estándar (sin Mg) Polimerasa TaqDNA con tampón ThermoPol Polimerasa EpiMark® Hot Start Número de producto M0495 M0273 M0320 M0267 M0490 Tampón suministrado Tampón de reacción Taq estándar Tampón de reacción Taq estándar Tampón de reacción Taq estándar (sin Mg) Tampón de reacción con 25 mM de MgCl2 Tampón de reacción ThermoPol® EpiMark® Hot Start Taq Composición del tampón suministrado a 1X (concentración final de la reacción) 10 mM Tris-HCl 50 mM KCl 1,5 mM MgCl2 (pH 8,3 a 25 °C) 10 mM Tris-HCl 50 mM KCl 1,5 mM MgCl2 pH 8,3 a 25 °C 0 mM Tris-HCl 50 mM KCl pH 8,3 a 25 °C 20 mM Tris-HCl 10 mM (NH4)2SO4 10 mM KCl 2 mM MgSO4 0,1 % Triton ® X-100 pH 8,8 a 25 °C 20 mM Tris-HCl 1,8 mM MgCl2 22 mM KCl 0,06 % IGEPAL® CA-630 0,05 % Tween ® 20 22 mM NH4Cl (pH 8,9 a 25 °C) Otros tampones compatibles *No se recomienda su uso en rCutSmart™ ni otros NEBuffers* Tampón de reacción ThermoPol® Tampón de reacción estándar OneTaq ® Tampón de reacción Taq LongAmp® Tampón de reacción ThermoPol® Tampón de reacción estándar OneTaq® Tampón de reacción Taq LongAmp® Tampón de reacción Taq estándar, tampón de reacción estándar OneTaq®, tampón de reacción Taq LongAmp®, tampón de reacción Taq estándar, tampón de reacción estándar One®, tampón de reacción Taq LongAmp®, tampón de reacción ThermoPol®, tampón de reacción Taq estándar. P: ¿Se pueden utilizar las ADN polimerasas Taq/OneTaq® para la traducción de mellas? R: Sí. Este tipo de actividad exonucleasa se puede utilizar para la traducción de mellas y también es una propiedad de la ADN polimerasa I (NEB# M0209). P: ¿Cómo puedo optimizar mi PCR al utilizar la ADN polimerasa Taq? R: Consulte la guía de uso.