New England Biolabs, M0500L, Q5® Blood Direct 2X Master Mix

Categorías relacionadas Mezclas maestras,, PCR, qPCR y tecnologías de amplificación Aplicaciones PCR sin extracción,, qPCR y RT-qPCR,, RT-qPCR de dos pasos, Especificación Inactivación por calor No Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la diferencia entre Q5® Blood Direct 2X Master Mix y Hemo KlenTaq (NEB #M0332)? R: Hemo KlenTaq es una polimerasa directa de sangre basada en una ADN polimerasa Taq mutante, mientras que Q5 Blood Direct 2X Master Mix contiene ADN polimerasa de alta fidelidad Q5 Hot Start. Q5 Blood Direct 2X Master Mix viene como una mezcla que contiene tampón y dNTP, así como enzima. Hemo KlenTaq es una enzima independiente con un tampón de reacción 5X separado que no contiene dNTP. Q5 Blood Direct 2X Master Mix se debe utilizar en aplicaciones donde se requiere un mayor grado de fidelidad, como cuando los productos de PCR se utilizarán en aplicaciones posteriores. Q5 Blood puede amplificar fragmentos de sangre humana de hasta 7,5 kb, mientras que Hemo KlenTaq no puede amplificar fragmentos de más de 2 kb. P: ¿Qué tipos de muestras/materiales son compatibles con la mezcla maestra Q5® Blood Direct 2X? R: Este kit se ha evaluado utilizando hasta un 40 % (v/v) de sangre humana entera conservada con anticoagulantes Na EDTA, K₂ EDTA, citrato de Na y heparina sódica. Sin embargo, sugerimos comenzar con un 5-10 % (v/v) de sangre. La mezcla maestra también se ha probado con punzones de sangre humana seca aplicados sobre papel Whatman® 903 y FTA. Recomendamos comenzar con un punzón de 0,5 mm en una reacción de 20 µL o un punzón de 1 mm en una reacción de 50 µL. P: ¿Qué concentración de sangre entera se recomienda para usar con Q5® Blood Direct 2X Master Mix? A: 5-10% (v/v) de sangre completa es la concentración inicial recomendada para Q5 Blood Direct 2X Master Mix. Es posible usar hasta un 40% de sangre, pero puede que sea necesario modificar las condiciones del ciclado. Para volúmenes de sangre mayores (≥ 20%) se recomienda un volumen de reacción de 50 µL debido a las dificultades en la recuperación de la fase acuosa de los restos de células sanguíneas que quedan después de la PCR. P: ¿Qué anticoagulantes sanguíneos se pueden usar con Q5® Blood Direct 2X Master Mix? R: Los anticoagulantes K2 EDTA, Na EDTA, citrato de Na y heparina de Na son compatibles con Q5 Blood Direct 2X Master Mix. P: ¿Cómo pretrato los punzones de gotas de sangre seca? R: Por lo general, no es necesario el pretratamiento para un solo punzón de 0,5 mm en una reacción de 20 µL o un solo punzón de 1 mm en una reacción de 50 µL. Sin embargo, cuando se usan más punzones o punzones más grandes, se pueden pretratar para evitar la posible inhibición de la PCR. Para el pretratamiento, coloque una sola punción en un tubo de PCR. Añada 50 µL de agua libre de nucleasas y caliente a 50 °C durante 5 minutos. Retire el sobrenadante con la punta de una pipeta y utilice la punción lavada en la reacción de PCR. P: ¿Qué longitud de producto puede obtenerse con Q5® Blood Direct 2X Master Mix? R: Hemos amplificado productos de hasta 7,5 kb a partir de células sanguíneas humanas. P: ¿Qué extremos tendrán mis productos de PCR? A: PRODUCTOS DE POLIMERASA DE APLICACIÓN PRODUCTO PCR EXTREMOS PCR de alta fidelidad Polimerasas Q5® Blunt Polimerasas Phusion® Blunt PCR de rutina y especial Polimerasas OneTaq® 3'A/blunt Polimerasas Taq 3'A Polimerasas LongAmp® 3'A/blunt Hemo KlenTaq Polimerasa 3'A Amplificación isotérmica Polimerasas Bst 3'A Polimerasa Bsu 3'A Polimerasa phi29 Blunt Manipulación de ADN Polimerasa de ADN T7 Blunt ADN polimerasa I de E. coli Blunt ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) Fragmento Klenow romo (3'-5' exo-) 3'A Polimerasa de ADN T4 Blunt Vent® Polimerasa Blunt Vent® (exo-) Polimerasa 3'A Polimerasa Deep Vent® Blunt Deep Vent® (exo-) Polimerasa 3'A Para más información Para obtener más información sobre nuestras polimerasas, incluidas las actividades y aplicaciones de las exonucleasas, visite nuestra Tabla de selección de ADN polimerasa. Más información Para obtener más información sobre la actividad de las exonucleasas, consulte estas preguntas frecuentes. ¿Por qué algunas polimerasas se embotan y otras añaden un nucleótido? Las polimerasas que poseen actividad de corrección (exonucleasa 3'-5'), como Q5, Phusion y Deep Vent, añadirán un nucleótido sin plantilla a los extremos 3' de los fragmentos de ADN extendidos, pero la actividad de la exonucleasa lo elimina posteriormente. Otras polimerasas que carecen de actividad de exonucleasa 3'-5' (como Taq y las polimerasas basadas en Taq) añadirán un nucleótido adicional a los extremos 3' (predominantemente, pero no exclusivamente, dA) y dejarán intacto el saliente sin plantilla. Por eso es importante saber qué polimerasa utilizar al realizar la clonación de extremos romos o T/A. Las ADN polimerasas OneTaq y LongAmp Taq son mezclas optimizadas de las ADN polimerasas Taq (una polimerasa de la Familia A) y Deep Vent (una polimerasa de la Familia B). La actividad intrínseca de la polimerasa de Taq añade un 3'A sin plantilla, mientras que la actividad de la exonucleasa 3'–5' de Deep Vent aumenta la fidelidad y robustez de Taq, pero también opaca los productos de PCR. Es por esto que estos productos producen una mezcla de extremos de ADN. Sin embargo, la mayoría de los extremos tendrán un saliente 3'A. P: ¿Qué son las polimerasas Hot Start y WarmStart® y cuándo debería usarlas? R: Al configurar reacciones a temperatura ambiente fuera del hielo Cuando se observa una amplificación no específica ¿Qué significa Hot Start/Warm Start? Nuestras polimerasas Hot Start y WarmStart utilizan aptámeros que inhiben la actividad enzimática a temperatura ambiente, lo que desalienta la formación de productos no específicos. La presencia de estos aptámeros no altera la función enzimática central. La diferencia entre Hot Start y WarmStart radica en que las enzimas Hot Start son termófilas, mientras que las WarmStart® son mesófilas. El rango termodinámico de los aptámeros para las enzimas Hot Start y WarmStart es en gran medida similar. Los aptámeros son oligonucleótidos modificados que se unen a una molécula diana específica mediante interacciones no covalentes e incluyen modificaciones específicas de nucleobases que pueden mejorar los perfiles de inhibición o reducir los efectos secundarios no deseados. La ventaja de la inhibición basada en aptámeros sobre otras tecnologías Hot Start (como los anticuerpos) es que no requieren un paso de activación y se unen de forma reversible, dependiendo de la temperatura. NEB ofrece polimerasas con aptámeros para PCR de rutina, PCR de alta fidelidad, amplificación isotérmica y transcripción inversa. Estos aptámeros pueden dirigirse a diferentes funciones enzimáticas para diferentes polimerasas. Más información. ¿Por qué se llama "Hot Start"? Al igual que muchas ADN polimerasas de la Familia A sin corrección de errores, la Taq Polimerasa posee la capacidad de añadir bases al extremo del ADNmc de forma independiente del molde, incluso a temperatura ambiente. Esto puede resultar en la adición de bases no específicas a los extremos de los cebadores de ADN en la reacción, lo que permite la hibridación inespecífica y reduce la especificidad general de la reacción. Por el contrario, a temperaturas más altas, la unión no específica se reduce a medida que la hibridación se vuelve más rigurosa. Los primeros métodos para mitigar la actividad no deseada a baja temperatura se centraban en la exclusión de componentes clave de la reacción hasta que se aumentaba la temperatura de reacción, lo que permitía añadirlos a la mezcla, desencadenando la reacción en condiciones más restrictivas y de alta temperatura. Lea nuestro artículo destacado, "Uso de aptámeros para controlar la actividad enzimática: Hot Start Taq y más allá", para ver datos que comparan la formación de producto en enzimas con y sin inhibición de la actividad basada en aptámeros. P: ¿Cuáles son las propiedades de esta polimerasa (fidelidad, extremos del producto, amplicón máximo, incorporación de bases modificadas, etc.)? A: FIDELIDAD DE LOS PRODUCTOS DE POLIMERASA* TASA DE ERROR EXTREMOS DEL PRODUCTO LONGITUD MÁXIMA DEL PRODUCTO** TEMPERATURA DE EXTENSIÓN INCORPORACIÓN DE NUCLEÓTIDOS MODIFICADOS*** INCORPORACIÓN DE URACILO 5´-3´ EXONUCLEASE 3´-5´ (CORRECCIÓN DE PRUEBAS) EXONUCLEASE Q5 Polimerasas 280X <0,44 x 10-6 Blunt 20 kb simple, 10 kb complejo 72 °C 5 mC, 5 hmC, 6 mA No (excepto Q5U) - ++++ Phusion Polimerasas 39-50X 0,44 x 10-6 Blunt 20 kb simple, 10 kb complejo 72 °C 5 mC, 5 hmC No - ++++ OneTaq Polimerasas 2X <140 x 10-6 3´A/romo 6 kb 68 °C 5 mC, 5 hmC, biotina, DIG Sí + ++ Taq Polimerasas 1X 2,85 x 10^-4 3´A 5 kb 68 °C 5 mC, 5 hmC, biotina, DIG Sí + - Hemo KlenTaq nt nt 3´A 2 kb 68 °C Sí No - LongAmp® Polimerasas 2X 3´A/romo 30 kb 65 °C No Sí ++ *Fidelidad relativa a la ADN polimerasa Taq. Seguimos investigando ensayos para caracterizar la tasa de error muy baja de Q5 para garantizar que presentamos los datos de fidelidad más precisos posibles (Potapov, V y Ong, JL (2017) PloS ONE, 12(1): e0169774). **Las plantillas simples incluyen ADN genómico plasmídico, viral y de E. coli. Las plantillas complejas incluyen ADN genómico y ADNc de plantas, humanos y otros mamíferos. *** Para obtener más información, contacte con el Soporte Técnico en info@neb.com. Para obtener más información sobre las propiedades que le ayudarán a seleccionar una polimerasa para su aplicación, consulte nuestra Tabla de Selección de ADN Polimerasas. Más información Fidelidad y tasa de error. La fidelidad de una ADN polimerasa se define por su capacidad para replicar con precisión una plantilla, mientras que la tasa de error es la tasa de incorporación incorrecta de un nucleótido incorrectamente emparejado. La fidelidad es importante para aplicaciones en las que la secuencia de ADN debe ser correcta después de la amplificación. Para obtener más información sobre cómo se mide la fidelidad, haga clic aquí. Extremos de producto y actividad de exonucleasa. Consulte la sección "Más información" en nuestras Preguntas frecuentes sobre extremos de producto de PCR y nuestras Preguntas frecuentes sobre actividad de exonucleasa para ADN polimerasas. P: Mis resultados no son los esperados. ¿Dónde puedo encontrar ayuda para la resolución de problemas? R: Amplificación inespecífica, sin amplificación, tamaño de producto incorrecto. ¿Le interesa el resultado? Consulte nuestra Guía de Solución de Problemas de PCR después de su reacción para identificar posibles causas de resultados inesperados y soluciones. Puede encontrar más detalles sobre las condiciones de reacción y la optimización de la configuración en nuestras Directrices para la Optimización de PCR con ADN Polimerasas Termófilas y en esta entrada del blog. El equipo de soporte técnico estará encantado de ayudarle a solucionar sus problemas de PCR. Si desea ayuda, puede: Enviarnos un correo electrónico a info@neb.com Llamar al soporte técnico al (800)-0632-7799, disponible de lunes a viernes, de 9:00 a. m. a 6:00 p. m., hora del este. Completar este formulario web. Error al amplificar un objetivo mayor a 5 kb. Si tiene dificultades para amplificar un objetivo mayor a 5 kb, pruebe algunos de estos consejos: Recomendamos usar polimerasas Q5®, Phusion® o LongAmp®. Si usa Q5, intente disminuir la concentración final del cebador a 150-300 nM. Las formulaciones independientes de enzima + tampón permiten mayor flexibilidad en la optimización de la reacción que las mezclas maestras. Use más plantilla. Trate la plantilla purificada con cuidado para no cortarla. Optimice la concentración de enzima probando una titulación de enzima en la reacción (reacciones de 0,25 a 2 unidades/50 μl). Aumente el número de ciclos. Alargue el tiempo de extensión a 40 s/kb. Untar en un gel de agarosa. Cuando las condiciones de PCR no son las adecuadas, óptimo, a menudo se observa una mancha o un alto nivel de fondo. Pruebe una o más de las siguientes sugerencias: Use menos enzima Disminuya la temperatura de extensión a 3 °C por debajo de la temperatura de extensión recomendada por el protocolo de producto específico Por ejemplo, el protocolo OneTaq® recomienda una temperatura de extensión de 68 °C; intente con 65 °C. Aumente la temperatura de hibridación Pruebe protocolos de ciclado de 2 pasos Si hay un halo iluminado alrededor del pocillo además de la mancha del pocillo, use menos plantilla. P: ¿Cuándo y cómo debo usar el Q5® High GC Enhancer? R: El Q5 High GC Enhancer es un aditivo que se debe usar cuando se trabaja con plantillas de GC particularmente difíciles o altas, pero puede ser inhibidor cuando se usan plantillas con alto contenido de AT. La enzima Q5 independiente puede cubrir un rango más amplio de contenido de GC (hasta 80%) con la adición del potenciador de GC. El potenciador Q5 High GC es un reactivo complementario a las formulaciones de enzimas y tampones Q5 (M0491 y M0493) y no debe usarse solo. *Este potenciador no es un tampón independiente y no debe usarse solo. Además, no debe añadirse a ninguna mezcla maestra Q5 (M0492, M0494, M0500, E0555). Q5U no se beneficia del potenciador Q5 High GC y no recomendamos su uso. La adición de aditivos comunes para PCR, como hasta un 2% de DMSO, puede mejorar la amplificación de ciertas dianas complejas o largas. A menudo no es necesario modificar la temperatura de annealing de la reacción después de añadir el potenciador Q5 High GC. Recomendamos usar nuestra calculadora de Tm para determinar la temperatura de annealing de la PCR. Más información El uso del Q5 High GC Enhancer a menudo reduce el rango efectivo de temperaturas en el que se puede observar la amplificación específica al reducir las estructuras secundarias de plantilla complejas, lo que puede aumentar la amplificación de su ADN objetivo y mejorar su rendimiento de productos difíciles de amplificar, como las plantillas ricas en GC. Generalmente, los aditivos de PCR suelen funcionar de una de dos maneras: Reduciendo las estructuras de ADN secundarias, lo que aumenta la amplificación de su ADN objetivo Las estructuras de ADN secundarias pueden desestabilizarse mediante aditivos que se unen a los surcos menores y mayores del ADN y afectan los enlaces de hidrógeno del dúplex. Las estructuras secundarias incluyen la doble hélice (mayor enlace de hidrógeno debido al mayor contenido de GC) y las estructuras de tallo-bucle (horquillas o nucleótidos abultados que reducen la hibridación) Al reducir el cebado no específico y, por lo tanto, reducir la amplificación de ADN fuera del objetivo.