New England Biolabs, M0515L, ADN polimerasa de alta fidelidad Q5U® Hot Start

Q5U Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase es una versión modificada de Q5 Categorías relacionadas Análisis de la metilación del ADN por conversión de bisulfito,, Análisis de la metilación del ADN,, PCR, qPCR y tecnologías de amplificación Aplicaciones Aplicaciones de las enzimas USER® y termolábiles USER II,, Secuenciación por bisulfito,, USER, ®, Clonación, Preguntas frecuentes P: ¿Cómo activo la prevención de contaminación por arrastre con Q5U? R: Para evitar la contaminación por arrastre, se pueden añadir dUTP (NEB #N0459) y UDG termolábil antártico (NEB #M0372) a la reacción. Para obtener mejores resultados, recomendamos añadir dUTP a una concentración final de 200 μM. dTTP se puede sustituir completamente por dUTP y para muchos objetivos, no se observa ninguna reducción en el rendimiento. Para la activación de UDG, se debe añadir un paso de incubación de 10 minutos a 25 °C antes del paso de desnaturalización inicial. Los parámetros típicos de ciclado se pueden utilizar posteriormente. P: ¿Puedo utilizar la ADN polimerasa de alta fidelidad Q5U Hot Start para amplificar ADN tratado con bisulfito? R: Sí. La ADN polimerasa de alta fidelidad Q5U Hot Start es una ADN polimerasa Q5 de alta fidelidad modificada que amplifica eficazmente las plantillas que contienen uracilo. Las condiciones óptimas de ciclado para el ADN tratado con bisulfito son diferentes a las de otras aplicaciones. Consulte la Sección 2 del protocolo para obtener más detalles. P: ¿Cuáles son las recomendaciones generales para diseñar cebadores para ADN tratado con bisulfito/desaminado? R: Recomendamos diseñar cebadores oligonucleótidos largos (~26-35) para amplificar ADN tratado con bisulfito/desaminado. Dado que el ADN con bisulfito suele dañarse, es más útil diseñar dianas entre 150 y 500 pb. Tenga en cuenta que, dado que las cadenas de ADN ya no son complementarias después del tratamiento con bisulfito/desaminación, un conjunto de cebadores individual solo amplificará una cadena de la secuencia diana. El primer cebador debe diseñarse para annealing a la secuencia diana convertida. El segundo cebador debe diseñarse para annealing al producto de extensión del primer cebador, no a la cadena molde opuesta, como sería el caso en PCR tradicional. Se recomiendan cebadores con temperaturas de annealing más altas (>60 °C según lo determinado por la calculadora NEB Tm) para un rendimiento óptimo. Si es necesario, incluya tantas guaninas como sea posible en la región de cebado o añada bases adicionales para aumentar la Tm. Los cebadores más largos también aumentarán la especificidad. Idealmente, se deben evitar los sitios CpG; si es esencial, inclúyalos en el extremo 5' del cebador y sintételos con una base mixta (Y = C/T, R = G/A) en la posición de la citosina. Se pueden utilizar programas informáticos como MethPrimer, methBLAST o BiSearch para diseñar o analizar cebadores. Los mejores resultados se observan típicamente cuando se utiliza cada cebador a una concentración final de 0,5 µM en la reacción. P: ¿Puedo usar la ADN polimerasa de alta fidelidad Q5U Hot Start para los métodos de clonación USER®? R: Sí. La ADN polimerasa Q5U Hot Start es una ADN polimerasa Q5 de alta fidelidad modificada que amplifica eficazmente moldes y cebadores que contienen uracilo. Para los métodos de clonación USER, las moléculas de ADN diana y el vector de clonación se generan mediante PCR con 8-12 bases de homología entre dos fragmentos. Los cebadores de PCR comienzan con una A 5′ y contienen un único residuo de desoxiuracilo (dU) que flanquea el extremo 3′ de la región de homología. Pueden diseñarse para permitir el ensamblaje de múltiples fragmentos, sustituciones, inserciones y/o deleciones de nucleótidos. Recomendamos usar el software GeneDesign para diseñar cebadores para las uniones USER. Los mejores resultados se obtienen generalmente al usar cada cebador a una concentración final de 0,5 µM. En comparación con las enzimas basadas en Taq, la ADN polimerasa de alta fidelidad Q5U Hot Start comete significativamente menos errores, lo que agiliza cualquier protocolo de clonación (por ejemplo, consulte los datos a continuación). La clonación USER se realizó para ligar un gen lacZ de 3 kb en una estructura principal del vector pET21a con la ADN polimerasa de alta fidelidad Q5U Hot Start y la ADN polimerasa Taq Hot Start. Las reacciones que contenían Q5U resultaron en una mayor eficiencia de ensamblaje y una mejor precisión, como lo demuestra el número total de colonias obtenidas (A) y el porcentaje de colonias azules (B). La precisión se examinó más a fondo utilizando la secuenciación de Sanger, que reveló una serie de mutaciones puntuales en las colonias azules obtenidas del ensamblaje de Taq y ninguna mutación de los 4 clones secuenciados de los experimentos Q5U (C). Las "X" indican el número de mutaciones adicionales encontradas en los clones producidos con Taq, lo que es consistente con resultados previos que demuestran la alta tolerancia a la mutación de lacZ. (Barnes, WM (1992) Gene, 112, 29-35.) P: ¿Puedo usar la ADN polimerasa de alta fidelidad Q5U Hot Start para amplificar ADN FFPE? R: Sí. La ADN polimerasa de alta fidelidad Q5U Hot Start es una ADN polimerasa Q5 modificada que puede amplificar varias bases modificadas que suelen estar presentes en moldes dañados. La amplificación exitosa de materiales derivados de FFPE será específica para el sustrato y la diana. P: ¿Qué extremos tendrán mis productos de PCR? A: PRODUCTOS DE POLIMERASA DE APLICACIÓN PRODUCTO PCR EXTREMOS PCR de alta fidelidad Polimerasas Q5® Blunt Polimerasas Phusion® Blunt PCR de rutina y especial Polimerasas OneTaq® 3'A/blunt Polimerasas Taq 3'A Polimerasas LongAmp® 3'A/blunt Hemo KlenTaq Polimerasa 3'A Amplificación isotérmica Polimerasas Bst 3'A Polimerasa Bsu 3'A Polimerasa phi29 Blunt Manipulación de ADN Polimerasa de ADN T7 Blunt ADN polimerasa I de E. coli Blunt ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) Fragmento Klenow romo (3'-5' exo-) 3'A Polimerasa de ADN T4 Blunt Vent® Polimerasa Blunt Vent® (exo-) Polimerasa 3'A Polimerasa Deep Vent® Blunt Deep Vent® (exo-) Polimerasa 3'A Para más información Para obtener más información sobre nuestras polimerasas, incluidas las actividades y aplicaciones de las exonucleasas, visite nuestra Tabla de selección de ADN polimerasa. Más información Para obtener más información sobre la actividad de las exonucleasas, consulte estas preguntas frecuentes. ¿Por qué algunas polimerasas se embotan y otras añaden un nucleótido? Las polimerasas que poseen actividad de corrección (exonucleasa 3'-5'), como Q5, Phusion y Deep Vent, añadirán un nucleótido sin plantilla a los extremos 3' de los fragmentos de ADN extendidos, pero la actividad de la exonucleasa lo elimina posteriormente. Otras polimerasas que carecen de actividad de exonucleasa 3'-5' (como Taq y las polimerasas basadas en Taq) añadirán un nucleótido adicional a los extremos 3' (predominantemente, pero no exclusivamente, dA) y dejarán intacto el saliente sin plantilla. Por eso es importante saber qué polimerasa utilizar al realizar la clonación de extremos romos o T/A. Las ADN polimerasas OneTaq y LongAmp Taq son mezclas optimizadas de las ADN polimerasas Taq (una polimerasa de la Familia A) y Deep Vent (una polimerasa de la Familia B). La actividad intrínseca de la polimerasa de Taq añade un 3'A sin plantilla, mientras que la actividad de la exonucleasa 3'–5' de Deep Vent aumenta la fidelidad y robustez de Taq, pero también opaca los productos de PCR. Es por esto que estos productos producen una mezcla de extremos de ADN. Sin embargo, la mayoría de los extremos tendrán un saliente 3'A. P: ¿Qué son las polimerasas Hot Start y WarmStart® y cuándo debería usarlas? R: Al configurar reacciones a temperatura ambiente fuera del hielo Cuando se observa una amplificación no específica ¿Qué significa Hot Start/Warm Start? Nuestras polimerasas Hot Start y WarmStart utilizan aptámeros que inhiben la actividad enzimática a temperatura ambiente, lo que desalienta la formación de productos no específicos. La presencia de estos aptámeros no altera la función enzimática central. La diferencia entre Hot Start y WarmStart radica en que las enzimas Hot Start son termófilas, mientras que las WarmStart® son mesófilas. El rango termodinámico de los aptámeros para las enzimas Hot Start y WarmStart es en gran medida similar. Los aptámeros son oligonucleótidos modificados que se unen a una molécula diana específica mediante interacciones no covalentes e incluyen modificaciones específicas de nucleobases que pueden mejorar los perfiles de inhibición o reducir los efectos secundarios no deseados. La ventaja de la inhibición basada en aptámeros sobre otras tecnologías Hot Start (como los anticuerpos) es que no requieren un paso de activación y se unen de forma reversible, dependiendo de la temperatura. NEB ofrece polimerasas con aptámeros para PCR de rutina, PCR de alta fidelidad, amplificación isotérmica y transcripción inversa. Estos aptámeros pueden dirigirse a diferentes funciones enzimáticas para diferentes polimerasas. Más información. ¿Por qué se llama "Hot Start"? Al igual que muchas ADN polimerasas de la Familia A sin corrección de errores, la Taq Polimerasa posee la capacidad de añadir bases al extremo del ADNmc de forma independiente del molde, incluso a temperatura ambiente, y puede resultar en la adición de bases no específicas a los extremos de los cebadores de ADN en la reacción, lo que permite la hibridación inespecífica y reduce la especificidad general de la reacción. Por el contrario, a temperaturas más altas, la unión no específica se reduce a medida que la hibridación se vuelve más rigurosa. Los primeros métodos para mitigar la actividad no deseada a baja temperatura se centraban en la exclusión de componentes clave de la reacción hasta que se aumentaba la temperatura de reacción, que luego se podían añadir a la mezcla, desencadenando la reacción en condiciones más restrictivas de alta temperatura. Lea nuestro artículo destacado, "Uso de aptámeros para controlar las actividades enzimáticas: Hot Start Taq y más allá", para ver datos que comparan la formación de productos para enzimas con y sin inhibición de la actividad basada en aptámeros. P: ¿Cómo debo determinar la temperatura de hibridación adecuada para mi reacción? R: La temperatura de hibridación óptima (Ta) para un par de cebadores se puede determinar empíricamente mediante una PCR en gradiente. Utilice la calculadora de Tm de NEB para determinar la temperatura de annealing inicial para su par de cebadores y la polimerasa/tampón NEB que se utilizará. A diferencia de otras calculadoras, la calculadora de Tm de NEB considera los componentes del tampón que afectan las temperaturas de fusión y las observaciones empíricas al calcular la temperatura de annealing óptima. Otras calculadoras en línea pueden subestimar la mejor temperatura de annealing para la polimerasa Q5. Para obtener más información sobre el uso de una única temperatura de annealing (es decir, "universal"), consulte nuestra nota de aplicación: Temperatura de annealing universal en PCR y su impacto en los resultados de amplificación. Más información. Una PCR eficiente es un equilibrio dinámico de sustancias químicas y reactivos que promueven la interacción de un cebador específico con su complemento en el molde a la temperatura de annealing seleccionada. Si bien las temperaturas de annealing son valores constantes seleccionados por el científico, las temperaturas de fusión entre cada cebador y el molde pueden variar de un amplicón a otro. Definiciones. Nota: esta sección trata específicamente sobre el annealing de un cebador de oligonucleótidos a un molde de ADN. Durante el paso de desnaturalización de la PCR, la alta temperatura separa el dsADN molde en ssADN, revelando secuencias de nucleótidos complejas que permiten la hibridación (unión, hibridación, asociación) de un cebador oligonucleótido monocatenario complementario a una temperatura más baja. La temperatura de hibridación (TA) es la temperatura utilizada durante el paso de hibridación del cebador de una PCR, que depende de la temperatura de fusión del cebador. La temperatura de fusión (TM) de un cebador es la temperatura a la que el 50% del cebador está unido a su complemento perfecto y el 50% está libre en solución debido a la disociación ("fusión") de su complemento. ¿Por qué es importante usar la temperatura de hibridación correcta para una PCR exitosa? La temperatura de hibridación de una reacción suele ser inferior a la temperatura de fusión para garantizar la hibridación del cebador con el molde. Si la temperatura de hibridación es demasiado alta, el cebador no se hibridará con el molde y la amplificación no continuará. Si la temperatura de annealing es demasiado baja, puede ocurrir una unión no específica del cebador(es) a la plantilla o entre sí (dímeros de cebador), causando: Mayor probabilidad de formación de producto no específico. Disminución de la formación del producto deseado debido a condiciones de reacción ineficientes. Reactivos de PCR que influyen en la temperatura de fusión del cebador y la temperatura de annealing de la reacción Las temperaturas de fusión no son valores constantes en una PCR y están influenciadas por varios factores: Longitud del cebador y proporción de guanina y citosina en relación con adenina y timina (% contenido de GC) Dicta la cantidad de enlaces de hidrógeno entre el cebador y su complemento. Cuanto mayor sea el enlace de hidrógeno (mayor Tm) de un cebador a su plantilla, más energía se necesita para romper esos enlaces (mayor temperatura). Concentración del cebador La temperatura de fusión de los cebadores en una PCR está determinada por las especies de ADN en exceso molar, que deberían ser los cebadores. Magnesio y dNTPs La concentración libre de iones magnesio [Mg2+] determina la temperatura de fusión de un dúplex de ADN, pero el magnesio puede ser secuestrado por los reactantes y productos de la PCR. La carga positiva del magnesio quela los fosfatos cargados negativamente de los dNTPs, cebadores y ssDNA. La reducción de las repulsiones electrostáticas (entre el cebador y los fosfatos del ssDNA) aumenta la concentración del cebador de cationes monovalentes (Na+, K+) Los cationes monovalentes apoyan la estabilidad del dúplex de ADN, de forma similar a los iones magnesio. Los cationes monovalentes y los iones magnesio compiten por la unión al ADN. El aumento de la concentración de cationes monovalentes disminuye la unión del magnesio al ADN. P: ¿Cuáles son las propiedades de esta polimerasa (fidelidad, extremos del producto, amplicón máximo, incorporación de bases modificadas, etc.)? A: FIDELIDAD DE LOS PRODUCTOS DE POLIMERASA* TASA DE ERROR EXTREMOS DEL PRODUCTO LONGITUD MÁXIMA DEL PRODUCTO** TEMPERATURA DE EXTENSIÓN INCORPORACIÓN DE NUCLEÓTIDOS MODIFICADOS*** INCORPORACIÓN DE URACILO 5´-3´ EXONUCLEASE 3´-5´ (CORRECCIÓN DE PRUEBAS) EXONUCLEASE Q5 Polimerasas 280X <0,44 x 10-6 Blunt 20 kb simple, 10 kb complejo 72 °C 5 mC, 5 hmC, 6 mA No (excepto Q5U) - ++++ Phusion Polimerasas 39-50X 0,44 x 10-6 Blunt 20 kb simple, 10 kb complejo 72 °C 5 mC, 5 hmC No - ++++ OneTaq Polimerasas 2X <140 x 10-6 3´A/romo 6 kb 68 °C 5 mC, 5 hmC, biotina, DIG Sí + ++ Taq Polimerasas 1X 2,85 x 10^-4 3´A 5 kb 68 °C 5 mC, 5 hmC, biotina, DIG Sí + - Hemo KlenTaq nt nt 3´A 2 kb 68 °C Sí No - LongAmp® Polimerasas 2X 3´A/romo 30 kb 65 °C No Sí ++ *Fidelidad relativa a la ADN polimerasa Taq. Seguimos investigando ensayos para caracterizar la tasa de error muy baja de Q5 para garantizar que presentamos los datos de fidelidad más precisos posibles (Potapov, V y Ong, JL (2017) PloS ONE, 12(1): e0169774). **Las plantillas simples incluyen ADN genómico plasmídico, viral y de E. coli. Las plantillas complejas incluyen ADN genómico y ADNc de plantas, humanos y otros mamíferos. *** Para obtener más información, contacte con el Soporte Técnico en info@neb.com. Para obtener más información sobre las propiedades que le ayudarán a seleccionar una polimerasa para su aplicación, consulte nuestra Tabla de Selección de ADN Polimerasas. Más información Fidelidad y tasa de error. La fidelidad de una ADN polimerasa se define por su capacidad para replicar con precisión una plantilla, mientras que la tasa de error es la tasa de incorporación incorrecta de un nucleótido incorrectamente emparejado. La fidelidad es importante para aplicaciones en las que la secuencia de ADN debe ser correcta después de la amplificación. Para obtener más información sobre cómo se mide la fidelidad, haga clic aquí. Extremos de producto y actividad de exonucleasa. Consulte la sección "Más información" en nuestras Preguntas frecuentes sobre extremos de producto de PCR y nuestras Preguntas frecuentes sobre actividad de exonucleasa para ADN polimerasas. P: Mis resultados no son los esperados. ¿Dónde puedo encontrar ayuda para la resolución de problemas? R: Amplificación inespecífica, ausencia de amplificación, tamaño de producto incorrecto. ¿Le interesa el resultado? Consulte nuestra Guía de Solución de Problemas de PCR después de su reacción para identificar posibles causas de resultados inesperados y soluciones. Puede encontrar más detalles sobre las condiciones de reacción y la optimización de la configuración en nuestras Directrices para la Optimización de PCR con ADN Polimerasas Termófilas y en esta entrada del blog. El equipo de soporte técnico estará encantado de ayudarle a solucionar sus problemas de PCR. Si desea ayuda, puede: Enviarnos un correo electrónico a info@neb.com Llamar al soporte técnico al (800)-0632-7799, disponible de lunes a viernes, de 9:00 a. m. a 6:00 p. m., hora del este. Completar este formulario web. Error al amplificar un objetivo mayor a 5 kb. Si tiene dificultades para amplificar un objetivo mayor a 5 kb, pruebe algunos de estos consejos: Recomendamos usar polimerasas Q5®, Phusion® o LongAmp®. Si usa Q5, intente disminuir la concentración final del cebador a 150-300 nM. Las formulaciones independientes de enzima + tampón permiten mayor flexibilidad en la optimización de la reacción que las mezclas maestras. Use más plantilla. Trate la plantilla purificada con cuidado para no cortarla. Optimice la concentración de enzima probando una titulación de enzima en la reacción (reacciones de 0,25 a 2 unidades/50 μl). Aumente el número de ciclos. Alargue el tiempo de extensión a 40 s/kb. Untar en un gel de agarosa. Cuando las condiciones de PCR no son las adecuadas, óptimo, a menudo se observa una mancha o un alto nivel de fondo. Pruebe una o más de las siguientes sugerencias: Use menos enzima Disminuya la temperatura de extensión a 3 °C por debajo de la temperatura de extensión recomendada por el protocolo de producto específico Por ejemplo, el protocolo OneTaq® recomienda una temperatura de extensión de 68 °C; intente con 65 °C. Aumente la temperatura de hibridación Pruebe protocolos de ciclado de 2 pasos Si hay un halo iluminado alrededor del pocillo además de la mancha del pocillo, use menos plantilla. P: ¿Cuáles son las diferencias entre los numerosos productos de polimerasa Q5® disponibles? R: Se recomiendan las formulaciones de enzimas independientes (NEB n.º M0491, n.º M0493) para una configuración de PCR flexible y para plantillas con alto contenido de GC (añadiendo el potenciador de GC alto a la reacción). Las formulaciones de mezcla maestra (NEB n.° M0492, n.° M0494) ofrecen la máxima comodidad al contener enzima, Mg2+, dNTP y todos los componentes del tampón necesarios para una amplificación robusta; solo es necesario añadir la plantilla y los cebadores. Las formulaciones de inicio rápido (NEB n.° M0493, n.° M0494) inhiben la actividad de la enzima, lo que permite una configuración de reacción a temperatura ambiente cómoda y son adecuadas para todas las aplicaciones de PCR que requieren mayor precisión, alta especificidad o la amplificación de dianas difíciles o largas. Para obtener más información sobre la tecnología de inicio rápido, haga clic aquí. Las formulaciones NEBNext® Q5 (NEB n.° M0541, n.° M0543, n.° M0544) se han optimizado específicamente para limitar el sesgo de GC durante la amplificación de bibliotecas NGS. M0544 es la mezcla maestra recomendada para aplicaciones NGS. La mezcla maestra Q5 Blood Direct 2X (NEB n.° M0500) está especialmente formulada para muestras de sangre sin necesidad de un paso de purificación. Es una enzima de inicio rápido. La polimerasa Q5 no puede leer ni incorporar uracilo, pero la ADN polimerasa de alta fidelidad Q5U® Hot Start (NEB n.° M0515) sí puede. Úsela con plantillas de ADN que contengan uracilo, convertidas con bisulfito, desaminadas o dañadas. La prevención de contaminación por arrastre se puede utilizar con Q5U y dUTP/dTTP. Es una enzima Hot Start. P: ¿Cuándo y cómo debo usar el potenciador de alta GC Q5®? R: El potenciador de alta GC Q5 es un aditivo que se debe usar cuando se trabaja con plantillas particularmente difíciles o con alta GC, pero puede ser inhibidor cuando se usan plantillas con alto contenido de AT. La enzima Q5 independiente puede cubrir un rango más amplio de contenido de GC (hasta un 80 %) con la adición del potenciador de GC. El potenciador de alta GC Q5 es un reactivo complementario a las formulaciones de enzima y tampón Q5 (M0491 y M0493) y no debe usarse solo. *Este potenciador no es un tampón independiente y no debe usarse solo. Además, no debe añadirse a ninguna mezcla maestra Q5 (M0492, M0494, M0500, E0555). Q5U no se beneficia del potenciador Q5 High GC y no recomendamos su uso. La adición de aditivos comunes de PCR, como hasta un 2% de DMSO, puede mejorar la amplificación de ciertos objetivos difíciles o largos. A menudo no es necesario alterar la temperatura de annealing de su reacción después de agregar el potenciador Q5 High GC. Recomendamos usar nuestra calculadora de Tm para determinar la temperatura de annealing de su PCR. Más información El uso del potenciador Q5 High GC a menudo reduce el rango efectivo de temperaturas a las que se puede observar una amplificación específica al reducir las estructuras secundarias complejas de la plantilla, lo que puede aumentar la amplificación de su ADN objetivo y mejorar su rendimiento de productos difíciles de amplificar, como las plantillas ricas en GC. Generalmente, los aditivos de PCR suelen funcionar de dos maneras: Reduciendo las estructuras de ADN secundarias, lo que aumenta la amplificación de su ADN diana Las estructuras de ADN secundarias pueden desestabilizarse mediante aditivos que se unen a los surcos menores y mayores del ADN y que afectan a los enlaces de hidrógeno del dúplex. Las estructuras secundarias incluyen la doble hélice (mayor enlace de hidrógeno debido al mayor contenido de GC) y las estructuras de tallo-bucle (horquillas o nucleótidos abultados que reducen la hibridación) Reduciendo el cebado no específico y, por lo tanto, reduciendo la amplificación de ADN fuera del objetivo. P: ¿Puedo usar el tampón de reacción Q5 con esta enzima? R: El tampón de reacción 5X Q5U que viene con la enzima se recomienda como el tampón de primera elección para una amplificación robusta y de alta fidelidad. El tampón de reacción 5X Q5U contiene 2,0 mM de Mg++ a una concentración final (1X). P: ¿Cómo puedo optimizar el rendimiento de mi producto utilizando la ADN polimerasa de alta fidelidad Q5U Hot Start? R: La optimización depende de la aplicación y el material de partida. Se pueden encontrar recomendaciones específicas en los protocolos. Las directrices generales se indican a continuación: Aplicar un gradiente de temperatura para optimizar la temperatura de fusión (Tm). A diferencia de otras polimerasas, como Taq, la amplificación de alta fidelidad puede ser sensible a las temperaturas de hibridación, donde uno o dos grados pueden marcar la diferencia entre la ausencia de amplificación y la amplificación exitosa de un producto puro con un alto rendimiento. Consulte los datos a continuación para ver un ejemplo. Utilice más plantillas. La concentración de la muestra podría ser demasiado baja. Optimice la concentración de enzima probando una titulación de enzima en la reacción (reacciones de 0,25 a 2 unidades/50 μl) Aumente el número de ciclos Alargue el tiempo de extensión a 1 min/kb Cambie la temperatura de extensión: algunas aplicaciones (amplificación de ADN tratado con bisulfito, desaminado o dañado) pueden beneficiarse del uso de una temperatura de extensión más alta que la recomendada (72 °C frente a 68 °C) La optimización de la temperatura de anexión puede mejorar los resultados de amplificación La amplificación de alta fidelidad de PSMB2 en función de la temperatura revela que la amplificación robusta comienza a 65,6 grados, mientras que se observa poca o ninguna amplificación un par de grados más abajo.