New England Biolabs, M0527S, Msz Exonucleasa I

Categorías relacionadas Exonucleasas y endonucleasas no específicas Especificación Unidad Definición Una unidad de Msz Exonucleasa I se define como la cantidad de enzima que catalizará la liberación de 5 nmol de nucleótido soluble en ácido en un volumen de reacción total de 100 μl en 15 minutos a 55 °C en tampón rCutSmart 1X. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 55 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Inactivación por calor 80 °C durante 1 minuto Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es el rango de temperatura de reacción óptimo para la actividad de Msz Exonucleasa I? R: La Msz Exonucleasa I es más activa entre 50 °C y 58 °C. No se recomiendan temperaturas inferiores a 45 °C ni superiores a 60 °C. P: ¿Puede la Msz Exonucleasa I eliminar cebadores en reacciones de PCR anidadas? R: Sí, añada 1 µl de Msz Exonucleasa I a la primera ronda de productos de PCR (hasta 20 µl) e incube la reacción a 55 °C durante 15 minutos, seguido de 80 °C durante 1 minuto para inactivar la enzima. A continuación, se pueden añadir nuevos conjuntos de cebadores seguidos de una segunda ronda de PCR para reducir los amplicones de PCR inespecíficos. P: ¿Puede utilizarse la Msz Exonucleasa I para embotar el dsADN? R: No. Los extremos cortos del ssADN no son un sustrato. Utilice la ADN polimerasa I, fragmento Klenow grande (NEB n.º M0210) para rellenar los salientes de 5′ y masticar los salientes de 3′, o utilice la nucleasa de frijol mungo (NEB n.º M0250) para masticar los salientes de 3′ o 5′. Nota: Los salientes de 3′ no se pueden rellenar. P: ¿Se puede inactivar por calor la Msz Exonucleasa I? R: Sí. Inactive la enzima por calor a 80 °C durante 1 minuto. P: ¿Se puede utilizar la Msz Exonucleasa I con una exonucleasa bicatenaria para limpiar preparaciones de plásmidos? R: No se recomienda. La mejor enzima para limpiar la contaminación del ADN genómico en preparaciones de plásmidos es la exonucleasa V (RecBCD, NEB n.º M0345). P: ¿Funcionará la Msz Exonucleasa I en otros tampones? R: Sí. La mayoría de los tampones de PCR son compatibles. No se necesita ningún tampón de reacción adicional si se añade la enzima a una reacción de PCR. La incubación en los siguientes tampones a 55 °C durante 15 minutos produjo la actividad relativa indicada: % de actividad del tampón NE r1.1 (NEB# B7030) 20 r2.1 (NEB# B6002) 50 r3.1 (NEB# B6003) 50 rCutSmartTM (NEB# B6004) 100 Tampón de reacción de exonucleasa I (NEB# B0293) 10 ThermoPol (NEB# B9004) 90