New England Biolabs, M0533S, Mezcla maestra LongAmp® Hot Start Taq 2X

Categorías relacionadas con LongAmp ADN polimerasas LongAmp®,, Mezclas maestras Aplicaciones PCR de inicio en caliente,, PCR de largo alcance,, PCR multiplex, Especificación Mezcla maestra 1X Composición Tris-SO4 60 mM (NH4)2SO4 2 mM MgSO4 3% Glicerol 0,06% IGEPAL® CA-630 0,05% Tween® 20 0,3 mM dNTPs 125 unidades/ml ADN polimerasa Taq de inicio en caliente LongAmp® pH 9,1 a 25 °C Inactivación por calor No Exonucleasa 5' - 3' Sí Exonucleasa 3' - 5' Sí Desplazamiento de cadena + Unidad Condiciones del ensayo Tampón de reacción ThermoPol® 1X, 200 µM dNTPs incluyendo [3H]-dTTP y 15 nM de ADN M13 cebado. Preguntas frecuentes P: ¿Qué extremos tendrán mis productos de PCR? A: PRODUCTOS DE POLIMERASA DE APLICACIÓN PRODUCTO PCR EXTREMOS PCR de alta fidelidad Polimerasas Q5® Blunt Polimerasas Phusion® Blunt PCR de rutina y especial Polimerasas OneTaq® 3'A/blunt Polimerasas Taq 3'A Polimerasas LongAmp® 3'A/blunt Hemo KlenTaq Polimerasa 3'A Amplificación isotérmica Polimerasas Bst 3'A Polimerasa Bsu 3'A Polimerasa phi29 Blunt Manipulación de ADN Polimerasa de ADN T7 Blunt ADN polimerasa I de E. coli Blunt ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) Fragmento Klenow romo (3'-5' exo-) 3'A Polimerasa de ADN T4 Blunt Vent® Polimerasa Blunt Vent® (exo-) Polimerasa 3'A Polimerasa Deep Vent® Blunt Deep Vent® (exo-) Polimerasa 3'A Para más información Para obtener más información sobre nuestras polimerasas, incluidas las actividades y aplicaciones de las exonucleasas, visite nuestra Tabla de selección de ADN polimerasa. Más información Para obtener más información sobre la actividad de las exonucleasas, consulte estas preguntas frecuentes. ¿Por qué algunas polimerasas se embotan y otras añaden un nucleótido? Las polimerasas que poseen actividad de corrección (exonucleasa 3'-5'), como Q5, Phusion y Deep Vent, añadirán un nucleótido sin plantilla a los extremos 3' de los fragmentos de ADN extendidos, pero la actividad de la exonucleasa lo elimina posteriormente. Otras polimerasas que carecen de actividad de exonucleasa 3'-5' (como Taq y las polimerasas basadas en Taq) añadirán un nucleótido adicional a los extremos 3' (predominantemente, pero no exclusivamente, dA) y dejarán intacto el saliente sin plantilla. Por eso es importante saber qué polimerasa utilizar al realizar la clonación de extremos romos o T/A. Las ADN polimerasas OneTaq y LongAmp Taq son mezclas optimizadas de las ADN polimerasas Taq (una polimerasa de la Familia A) y Deep Vent (una polimerasa de la Familia B). La actividad intrínseca de la polimerasa de Taq añade un 3'A sin plantilla, mientras que la actividad de la exonucleasa 3'–5' de Deep Vent aumenta la fidelidad y robustez de Taq, pero también opaca los productos de PCR. Es por esto que estos productos producen una mezcla de extremos de ADN. Sin embargo, la mayoría de los extremos tendrán un saliente 3'A. P: ¿Qué son las polimerasas Hot Start y WarmStart® y cuándo debería usarlas? R: Al configurar reacciones a temperatura ambiente fuera del hielo Cuando se observa una amplificación no específica ¿Qué significa Hot Start/Warm Start? Nuestras polimerasas Hot Start y WarmStart utilizan aptámeros que inhiben la actividad enzimática a temperatura ambiente, lo que desalienta la formación de productos no específicos. La presencia de estos aptámeros no altera la función enzimática central. La diferencia entre Hot Start y WarmStart radica en que las enzimas Hot Start son termófilas, mientras que las WarmStart® son mesófilas. El rango termodinámico de los aptámeros para las enzimas Hot Start y WarmStart es en gran medida similar. Los aptámeros son oligonucleótidos modificados que se unen a una molécula diana específica mediante interacciones no covalentes e incluyen modificaciones específicas de nucleobases que pueden mejorar los perfiles de inhibición o reducir los efectos secundarios no deseados. La ventaja de la inhibición basada en aptámeros sobre otras tecnologías Hot Start (como los anticuerpos) es que no requieren un paso de activación y se unen de forma reversible, dependiendo de la temperatura. NEB ofrece polimerasas con aptámeros para PCR de rutina, PCR de alta fidelidad, amplificación isotérmica y transcripción inversa. Estos aptámeros pueden dirigirse a diferentes funciones enzimáticas para diferentes polimerasas. Más información. ¿Por qué se llama "Hot Start"? Al igual que muchas ADN polimerasas de la Familia A sin corrección de errores, la Taq Polimerasa posee la capacidad de añadir bases al extremo del ADNmc de forma independiente del molde, incluso a temperatura ambiente, y puede resultar en la adición de bases no específicas a los extremos de los cebadores de ADN en la reacción, lo que permite la hibridación inespecífica y reduce la especificidad general de la reacción. Por el contrario, a temperaturas más altas, la unión no específica se reduce a medida que la hibridación se vuelve más rigurosa. Los primeros métodos para mitigar la actividad no deseada a baja temperatura se centraban en la exclusión de componentes clave de la reacción hasta que se aumentaba la temperatura de reacción, que luego se podían añadir a la mezcla, desencadenando la reacción en condiciones más restrictivas de alta temperatura. Lea nuestro artículo destacado, "Uso de aptámeros para controlar las actividades enzimáticas: Hot Start Taq y más allá", para ver datos que comparan la formación de productos para enzimas con y sin inhibición de la actividad basada en aptámeros. P: ¿Cómo debo determinar la temperatura de hibridación adecuada para mi reacción? R: La temperatura de hibridación óptima (Ta) para un par de cebadores se puede determinar empíricamente mediante una PCR en gradiente. Utilice la calculadora de Tm de NEB para determinar la temperatura de annealing inicial para su par de cebadores y la polimerasa/tampón NEB que se utilizará. A diferencia de otras calculadoras, la calculadora de Tm de NEB considera los componentes del tampón que afectan las temperaturas de fusión y las observaciones empíricas al calcular la temperatura de annealing óptima. Otras calculadoras en línea pueden subestimar la mejor temperatura de annealing para la polimerasa Q5. Para obtener más información sobre el uso de una única temperatura de annealing (es decir, "universal"), consulte nuestra nota de aplicación: Temperatura de annealing universal en PCR y su impacto en los resultados de amplificación. Más información. Una PCR eficiente es un equilibrio dinámico de sustancias químicas y reactivos que promueven la interacción de un cebador específico con su complemento en el molde a la temperatura de annealing seleccionada. Si bien las temperaturas de annealing son valores constantes seleccionados por el científico, las temperaturas de fusión entre cada cebador y el molde pueden variar de un amplicón a otro. Definiciones. Nota: esta sección trata específicamente sobre el annealing de un cebador de oligonucleótidos a un molde de ADN. Durante el paso de desnaturalización de la PCR, la alta temperatura separa el dsADN molde en ssADN, revelando secuencias de nucleótidos complejas que permiten la hibridación (unión, hibridación, asociación) de un cebador oligonucleótido monocatenario complementario a una temperatura más baja. La temperatura de hibridación (TA) es la temperatura utilizada durante el paso de hibridación del cebador de una PCR, que depende de la temperatura de fusión del cebador. La temperatura de fusión (TM) de un cebador es la temperatura a la que el 50% del cebador está unido a su complemento perfecto y el 50% está libre en solución debido a la disociación ("fusión") de su complemento. ¿Por qué es importante usar la temperatura de hibridación correcta para una PCR exitosa? La temperatura de hibridación de una reacción generalmente es menor que la temperatura de fusión para asegurar la hibridación del cebador con el molde. Si la temperatura de hibridación es demasiado alta, el cebador no se hibridará con el molde y la amplificación no continuará. Si la temperatura de annealing es demasiado baja, puede ocurrir una unión no específica del cebador(es) a la plantilla o entre sí (dímeros de cebador), causando: Mayor probabilidad de formación de producto no específico. Disminución de la formación del producto deseado debido a condiciones de reacción ineficientes. Reactivos de PCR que influyen en la temperatura de fusión del cebador y la temperatura de annealing de la reacción Las temperaturas de fusión no son valores constantes en una PCR y están influenciadas por varios factores: Longitud del cebador y proporción de guanina y citosina en relación con adenina y timina (% contenido de GC) Dicta la cantidad de enlaces de hidrógeno entre el cebador y su complemento. Cuanto mayor sea el enlace de hidrógeno (mayor Tm) de un cebador a su plantilla, más energía se necesita para romper esos enlaces (mayor temperatura). Concentración del cebador La temperatura de fusión de los cebadores en una PCR está determinada por las especies de ADN en exceso molar, que deberían ser los cebadores. Magnesio y dNTPs La concentración libre de iones magnesio [Mg2+] determina la temperatura de fusión de un dúplex de ADN, pero el magnesio puede ser secuestrado por los reactantes y productos de la PCR. La carga positiva del magnesio quela los fosfatos cargados negativamente de los dNTPs, cebadores y ssDNA. La reducción de las repulsiones electrostáticas (entre el cebador y los fosfatos del ssDNA) aumenta la concentración del cebador de cationes monovalentes (Na+, K+) Los cationes monovalentes apoyan la estabilidad del dúplex de ADN, de forma similar a los iones magnesio. Los cationes monovalentes y los iones magnesio compiten por la unión al ADN. El aumento de la concentración de cationes monovalentes disminuye la unión del magnesio al ADN. P: ¿Cuáles son las propiedades de esta polimerasa (fidelidad, extremos del producto, amplicón máximo, incorporación de bases modificadas, etc.)? A: FIDELIDAD DE LOS PRODUCTOS DE POLIMERASA* TASA DE ERROR EXTREMOS DEL PRODUCTO LONGITUD MÁXIMA DEL PRODUCTO** TEMPERATURA DE EXTENSIÓN INCORPORACIÓN DE NUCLEÓTIDOS MODIFICADOS*** INCORPORACIÓN DE URACILO 5´-3´ EXONUCLEASE 3´-5´ (CORRECCIÓN DE PRUEBAS) EXONUCLEASE Q5 Polimerasas 280X <0,44 x 10-6 Blunt 20 kb simple, 10 kb complejo 72 °C 5 mC, 5 hmC, 6 mA No (excepto Q5U) - ++++ Phusion Polimerasas 39-50X 0,44 x 10-6 Blunt 20 kb simple, 10 kb complejo 72 °C 5 mC, 5 hmC No - ++++ OneTaq Polimerasas 2X <140 x 10-6 3´A/romo 6 kb 68 °C 5 mC, 5 hmC, biotina, DIG Sí + ++ Taq Polimerasas 1X 2,85 x 10^-4 3´A 5 kb 68 °C 5 mC, 5 hmC, biotina, DIG Sí + - Hemo KlenTaq nt nt 3´A 2 kb 68 °C Sí No - LongAmp® Polimerasas 2X 3´A/romo 30 kb 65 °C No Sí ++ *Fidelidad relativa a la ADN polimerasa Taq. Seguimos investigando ensayos para caracterizar la tasa de error muy baja de Q5 para garantizar que presentamos los datos de fidelidad más precisos posibles (Potapov, V y Ong, JL (2017) PloS ONE, 12(1): e0169774). **Las plantillas simples incluyen ADN genómico plasmídico, viral y de E. coli. Las plantillas complejas incluyen ADN genómico y ADNc de plantas, humanos y otros mamíferos. *** Para obtener más información, contacte con el Soporte Técnico en info@neb.com. Para obtener más información sobre las propiedades que le ayudarán a seleccionar una polimerasa para su aplicación, consulte nuestra Tabla de Selección de ADN Polimerasas. Más información Fidelidad y tasa de error. La fidelidad de una ADN polimerasa se define por su capacidad para replicar con precisión una plantilla, mientras que la tasa de error es la tasa de incorporación incorrecta de un nucleótido incorrectamente emparejado. La fidelidad es importante para aplicaciones en las que la secuencia de ADN debe ser correcta después de la amplificación. Para obtener más información sobre cómo se mide la fidelidad, haga clic aquí. Extremos de producto y actividad de exonucleasa. Consulte la sección "Más información" en nuestras Preguntas frecuentes sobre extremos de producto de PCR y nuestras Preguntas frecuentes sobre actividad de exonucleasa para ADN polimerasas. P: Mis resultados no son los esperados. ¿Dónde puedo encontrar ayuda para la resolución de problemas? R: Amplificación inespecífica, sin amplificación, tamaño de producto incorrecto. ¿Le interesa el resultado? Consulte nuestra Guía de Solución de Problemas de PCR después de su reacción para identificar posibles causas de resultados inesperados y soluciones. Puede encontrar más detalles sobre las condiciones de reacción y la optimización de la configuración en nuestras Directrices para la Optimización de PCR con ADN Polimerasas Termófilas y en esta entrada del blog. El equipo de soporte técnico estará encantado de ayudarle a solucionar sus problemas de PCR. Si desea ayuda, puede: Enviarnos un correo electrónico a info@neb.com Llamar al soporte técnico al (800)-0632-7799, disponible de lunes a viernes, de 9:00 a. m. a 6:00 p. m., hora del este. Completar este formulario web. Error al amplificar un objetivo mayor a 5 kb. Si tiene dificultades para amplificar un objetivo mayor a 5 kb, pruebe algunos de estos consejos: Recomendamos usar polimerasas Q5®, Phusion® o LongAmp®. Si usa Q5, intente disminuir la concentración final del cebador a 150-300 nM. Las formulaciones independientes de enzima + tampón permiten mayor flexibilidad en la optimización de la reacción que las mezclas maestras. Use más plantilla. Trate la plantilla purificada con cuidado para no cortarla. Optimice la concentración de enzima probando una titulación de enzima en la reacción (reacciones de 0,25 a 2 unidades/50 μl). Aumente el número de ciclos. Alargue el tiempo de extensión a 40 s/kb. Untar en un gel de agarosa. Cuando las condiciones de PCR no son las adecuadas, óptimo, a menudo se observa una mancha o un alto nivel de fondo. Pruebe una o más de las siguientes sugerencias: Use menos enzima Disminuya la temperatura de extensión a 3 °C por debajo de la temperatura de extensión recomendada por el protocolo de producto específico Por ejemplo, el protocolo OneTaq® recomienda una temperatura de extensión de 68 °C; intente con 65 °C. Aumente la temperatura de hibridación Pruebe protocolos de ciclado de 2 pasos Si hay un halo iluminado alrededor del pocillo además de la mancha del pocillo, use menos plantilla. P: ¿El ADNg purificado con Monarch es adecuado para la PCR de largo alcance? R: Sí. El gran tamaño de fragmento del ADNg purificado con Monarch lo convierte en un excelente material de partida para los enfoques de PCR de largo alcance. Para la PCR de largo alcance, recomendamos LongAmp TaqDNA Polymerase (NEB #M0323), LongAmp Taq 2x Master Mix (NEB #M0287) o LongAmp Hot Start Taq Polymerase (NEB #M0534). El ADN genómico purificado con el kit de extracción de ADN genómico Monarch Spin es de alta calidad y adecuado para aplicaciones sensibles como PCR de largo alcance y qPCR A. Las reacciones de amplificación se configuraron con pares de cebadores específicos para amplicones de 6, 8, 10, 12, 16 y 20 kb de ADN humano. Se utilizó la mezcla maestra LongAmp® Hot Start Taq 2x (NEB n.º M0533) y se añadieron 25 ng de ADN molde a cada muestra. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un termociclador Applied Biosystems 2720. El ADN genómico purificado con Monarch, aislado de células HeLa y sangre humana, se comparó con el ADN de referencia disponible comercialmente de la línea celular humana NA19240 F11. Se cargaron 10 de 20 μl en un gel de agarosa al 1,5 %, utilizando la escalera de ADN de 1 kb (NEB n.º N3232) como marcador. Los resultados indicaron que el ADN era de alta integridad y adecuado para PCR de largo alcance. B. El ADN genómico purificado con Monarch, procedente de sangre humana, células HeLa y cola de ratón, se diluyó para obtener un rango de cinco logaritmos de concentraciones de plantilla de entrada. Los resultados se generaron utilizando cebadores dirigidos a gHEME (sangre humana) y gREL (HeLa, cola de ratón) para ensayos de qPCR con la mezcla maestra Luna Universal qPCR (NEB n.° M3003) y se ciclaron en un termociclador Bio-Rad® CFX Touch para qPCR. Los resultados indicaron que el ADN es altamente puro y libre de inhibidores, óptimo para la qPCR.