New England Biolabs, M0536L, Mezcla maestra Phusion™ Hot Start Flex 2X

Para PCR de alta velocidad y alto rendimiento. Fabricado y con control de calidad en New England Biolabs, Thermo Scientific. Categorías relacionadas: ADN polimerasas de alta fidelidad Phusion™, mezclas maestras. Aplicaciones: PCR de inicio en caliente, PCR de largo alcance, PCR rápida. Especificaciones: Inactivación por calor. Sin unidad. Condiciones de ensayo: 25 mM TAPS-HCl (pH 9,3 a 25 °C), 50 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM β-mercaptoetanol, 200 µM dNTP, incluyendo [₃H]-dTTP, y 15 nM de ADN M13 cebado. Preguntas frecuentes : P: ¿Cuáles son las diferencias entre los distintos productos Phusion™ disponibles? R: Los formatos enzimáticos independientes (NEB n.° M0530, M0535 y E0553) de la polimerasa Phusion ofrecen la máxima flexibilidad para la optimización de la reacción y se suministran con dos tampones: HF y GC. El tampón HF es el predeterminado. El tampón GC debe utilizarse cuando el tampón HF falla o cuando las plantillas contienen un alto contenido de GC o estructuras secundarias. Tanto el paquete de tampón HF (NEB n.° B0518) como el paquete de tampón GC (NEB n.° B0519) están disponibles para su compra individual. Ofrecemos formulaciones de mezcla maestra Phusion premezcladas con el tampón HF (NEB n.° M0531) o el tampón GC (NEB n.° M0532) y dNTP; solo tiene que añadir la plantilla y los cebadores. Las versiones de inicio rápido de la polimerasa Phusion independiente (NEB n.° M0535) y la mezcla maestra (NEB n.° M0536) permiten la configuración a temperatura ambiente y pueden reducir la amplificación inespecífica durante la rampa inicial. Para obtener más información sobre el control de la actividad enzimática Hot Start, haga clic aquí. El kit de PCR de alta fidelidad Phusion (NEB n.° E0553) contiene todos los reactivos necesarios para la PCR, incluyendo dNTP, DMSO, un control positivo y una escalera de ADN para la posterior electroforesis en gel. P: Mis resultados no son los esperados. ¿Dónde puedo encontrar ayuda para la resolución de problemas? R: Amplificación inespecífica, ausencia de amplificación, tamaño de producto incorrecto. ¿Le interesa el resultado? Consulte nuestra Guía de resolución de problemas de PCR después de su reacción para identificar las posibles causas de resultados inesperados y sus soluciones. Puede encontrar más detalles sobre las condiciones de reacción y la optimización de la configuración en nuestras Directrices para la optimización de PCR con ADN polimerasas termófilas y en esta entrada del blog. El soporte técnico estará encantado de ayudarle a resolver sus problemas de PCR. Si desea ayuda, puede: Enviarnos un correo electrónico a info@neb.com Llamar al soporte técnico al (800)-0632-7799, disponible de lunes a viernes, de 9:00 a. m. a 6:00 p. m., hora del este. Completar este formulario web. Error al amplificar un objetivo mayor a 5 kb. Si tiene dificultades para amplificar un objetivo mayor a 5 kb, pruebe algunos de estos consejos: Recomendamos usar polimerasas Q5®, Phusion® o LongAmp®. Si usa Q5, intente disminuir la concentración final del cebador a 150-300 nM. Las formulaciones independientes de enzima + tampón permiten mayor flexibilidad en la optimización de la reacción que las mezclas maestras. Use más plantilla. Trate la plantilla purificada con cuidado para no cortarla. Optimice la concentración de enzima probando una titulación de enzima en la reacción (reacciones de 0,25 a 2 unidades/50 μl). Aumente el número de ciclos. Alargue el tiempo de extensión a 40 s/kb. Untar en un gel de agarosa. Cuando las condiciones de PCR no son las adecuadas, En condiciones óptimas, suele observarse una mancha o un alto nivel de fondo. Pruebe una o más de las siguientes sugerencias: Use menos enzima. Reduzca la temperatura de extensión a 3 °C por debajo de la temperatura de extensión recomendada por el protocolo específico del producto. Por ejemplo, el protocolo OneTaq® recomienda una temperatura de extensión de 68 °C; pruebe con 65 °C. Aumente la temperatura de hibridación. Pruebe protocolos de ciclado de 2 pasos. Si, además de la mancha, se observa un halo iluminado alrededor del pocillo, use menos plantilla. P: ¿Qué extremos tendrán mis productos de PCR? A: PRODUCTOS DE POLIMERASA DE APLICACIÓN PRODUCTO PCR EXTREMOS PCR de alta fidelidad Polimerasas Q5® Blunt Polimerasas Phusion® Blunt PCR de rutina y especial Polimerasas OneTaq® 3'A/blunt Polimerasas Taq 3'A Polimerasas LongAmp® 3'A/blunt Hemo KlenTaq Polimerasa 3'A Amplificación isotérmica Polimerasas Bst 3'A Polimerasa Bsu 3'A Polimerasa phi29 Blunt Manipulación de ADN Polimerasa de ADN T7 Blunt ADN polimerasa I de E. coli Blunt ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) Fragmento Klenow romo (3'-5' exo-) 3'A Polimerasa de ADN T4 Blunt Vent® Polimerasa Blunt Vent® (exo-) Polimerasa 3'A Polimerasa Deep Vent® Blunt Deep Vent® (exo-) Polimerasa 3'A Para más información Para obtener más información sobre nuestras polimerasas, incluidas las actividades y aplicaciones de las exonucleasas, visite nuestra Tabla de selección de ADN polimerasa. Más información Para obtener más información sobre la actividad de las exonucleasas, consulte estas preguntas frecuentes. ¿Por qué algunas polimerasas se embotan y otras añaden un nucleótido? Las polimerasas que poseen actividad de corrección (exonucleasa 3'-5'), como Q5, Phusion y Deep Vent, añadirán un nucleótido sin plantilla a los extremos 3' de los fragmentos de ADN extendidos, pero la actividad de la exonucleasa lo elimina posteriormente. Otras polimerasas que carecen de actividad de exonucleasa 3'-5' (como Taq y las polimerasas basadas en Taq) añadirán un nucleótido adicional a los extremos 3' (predominantemente, pero no exclusivamente, dA) y dejarán intacto el saliente sin plantilla. Por eso es importante saber qué polimerasa utilizar al realizar la clonación de extremos romos o T/A. Las ADN polimerasas OneTaq y LongAmp Taq son mezclas optimizadas de las ADN polimerasas Taq (una polimerasa de la Familia A) y Deep Vent (una polimerasa de la Familia B). La actividad polimerasa intrínseca de Taq añade un extremo 3'A sin plantilla, mientras que la actividad exonucleasa 3'–5' de Deep Vent aumenta la fidelidad y robustez de Taq, pero también opaca los productos de PCR. Es por esto que estos productos producen una mezcla de extremos de ADN. Sin embargo, la mayoría de los extremos tendrán un saliente 3'A. P: ¿Qué significa la actividad exonucleasa para una ADN polimerasa? R: Las polimerasas pueden poseer hasta dos tipos de actividad exonucleasa: la actividad exonucleasa 5'- 3' digerirá los nucleótidos en la dirección 5' a 3' en una plantilla antes de la actividad polimerasa. La Taq polimerasa posee un tipo específico de actividad exonucleasa 5'-3' llamada actividad endonucleasa de colgajo 5', que cataliza la escisión de los colgajos de ADN 5' de un dúplex de ADN que tiene un saliente 5' monocatenario en una de las cadenas. La actividad exonucleasa 3' - 5', también conocida como actividad de corrección, digiere nucleótidos con grupos hidroxilo 3' de la dirección 3' a 5'. Esto incluye la corrección de pares de bases desapareados y la digestión terminal 3'. Algunas polimerasas poseen uno o ambos tipos de estos tipos de actividades exonucleasas. En presencia de dNTP, la actividad de polimerización es mayor que la actividad exonucleasa. Algunas polimerasas no poseen ninguna de estas actividades. Más información ¿Qué significa cuando una polimerasa tiene actividad exonucleasa 5'- 3'? Cuando las polimerasas con actividad de exonucleasa 5'- 3' encuentran un nucleótido corriente abajo en la misma cadena, los enlaces fosfodiéster de la cadena encontrada se hidrolizan (digieren) antes de la polimerización. La Taq polimerasa posee un tipo específico de actividad de exonucleasa 5'- 3' llamada actividad de endonucleasa de colgajo 5', que cataliza la escisión de los colgajos de ADN 5' de un dúplex de ADN que tiene un saliente 5' monocatenario en una de las cadenas. Cuando la Taq polimerasa encuentra una estructura de colgajo de este tipo, como el fluoróforo en una sonda de hidrólisis de qPCR, digiere secuencialmente los enlaces fosfodiéster entre nucleótidos en la dirección 5'- 3' antes de la polimerización. La relación entre la actividad de exonucleasa 3' - 5' (corrección) y la longitud del producto de PCR. Las ADN polimerasas garantizan una replicación precisa mediante una serie de puntos de control molecular en el sitio de incorporación de nucleótidos y más allá. Durante la adición de nucleótidos, el nucleótido entrante correcto se posiciona para una alineación productiva de los grupos catalíticos, lo que garantiza una incorporación eficiente. Esta alineación para la catálisis es sensible a las distorsiones en la posición causadas por un apareamiento de bases Watson-Crick incorrecto, lo que permite el estancamiento cinético en pares de bases incorrectos o no cognados. Las polimerasas con actividad de corrección de errores "verifican" si se ha insertado o no el nucleótido correcto en la plantilla. Si se detecta un desajuste, el ADN se transfiere del dominio de polimerización al dominio exonucleasa 3'-5' N-terminal de la polimerasa. El nucleótido incorporado incorrectamente se escinde, el ADN regresa al dominio de polimerización y se puede reanudar la copia. La ausencia de actividad exonucleasa 3'-5' (corrección de errores) puede tener ramificaciones más allá de la fidelidad en la PCR. Se ha propuesto que la falta de actividad de corrección de pruebas en la Taq ADN polimerasa limita el tamaño máximo posible del amplicón. Generalmente, Taq funciona mejor al amplificar fragmentos de ADN < 2 kb, pero puede funcionar con fragmentos de hasta 3-4 kb. Cuando se mantiene a este tamaño de amplicón, Taq es una enzima robusta y fácilmente optimizada. Sin embargo, con productos por encima de ~3 kb, su efectividad disminuye rápidamente. Durante la PCR, Taq incorporará nucleótidos incorrectamente y producirá desajustes, lo que la hace propensa al estancamiento y más propensa a disociarse antes de extender el producto de longitud completa. La combinación de un cierto tamaño de amplicón y la tasa de error de la polimerasa puede resultar en la acumulación de suficientes extremos 3' desapareados para inhibir eficazmente el proceso de PCR. Estos extremos 3' desapareados son particularmente problemáticos para Taq porque carece de la actividad exonucleasa 3'→ 5' para eliminarlos. Al mezclar una pequeña cantidad de una polimerasa con actividad exonucleasa correctora, como la ADN polimerasa Deep Vent®, se puede lograr la amplificación de fragmentos ≥ 20 kb (ver ADN polimerasa LongAmp®). Dado que la gran mayoría de la enzima en la mezcla es Taq ADN polimerasa, probablemente esté realizando la mayor parte de la extensión del cebador, con la ADN polimerasa correctora Deep Vent eliminando los desajustes inhibidores 3' generados por Taq. Para aprender más sobre la anatomía de una polimerasa y cómo la estructura se relaciona con la función, vea este artículo destacado. ¿Cómo bloquear la actividad exonucleasa durante la PCR? Añada enlaces fosforotioato a los cebadores. Un enlace fosforotioato (pt) es un enlace fosfodiéster donde uno de los dos oxígenos no puente ha sido reemplazado por un átomo de azufre, lo que inhibe la actividad fosfodiesterasa de la nucleasa. Químicamente, la sustitución de oxígeno por azufre no altera drásticamente la reactividad del enlace, y los polinucleótidos que contienen pt pueden seguir funcionando en muchas reacciones enzimáticas. En la mayoría de los contextos, los enlaces 2-3 pt en el extremo 3' son suficientes para bloquear la actividad de la exonucleasa 3'-5' de la polimerasa. P: ¿Presenta la ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion™ actividad de desplazamiento de cadena? R: No. La ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion tiene una tendencia extremadamente baja a desplazar secuencias posteriores no moldeadas, por lo que no se considera una propiedad de la enzima. P: ¿Cuáles son las propiedades de esta polimerasa (fidelidad, extremos del producto, amplicón máximo, incorporación de bases modificadas, etc.)? A: FIDELIDAD DE LOS PRODUCTOS DE POLIMERASA* TASA DE ERROR EXTREMOS DEL PRODUCTO LONGITUD MÁXIMA DEL PRODUCTO** TEMPERATURA DE EXTENSIÓN INCORPORACIÓN DE NUCLEÓTIDOS MODIFICADOS*** INCORPORACIÓN DE URACILO 5´-3´ EXONUCLEASE 3´-5´ (CORRECCIÓN DE PRUEBAS) EXONUCLEASE Q5 Polimerasas 280X <0,44 x 10-6 Blunt 20 kb simple, 10 kb complejo 72 °C 5 mC, 5 hmC, 6 mA No (excepto Q5U) - ++++ Phusion Polimerasas 39-50X 0,44 x 10-6 Blunt 20 kb simple, 10 kb complejo 72 °C 5 mC, 5 hmC No - ++++ OneTaq Polimerasas 2X <140 x 10-6 3´A/romo 6 kb 68 °C 5 mC, 5 hmC, biotina, DIG Sí + ++ Taq Polimerasas 1X 2,85 x 10^-4 3´A 5 kb 68 °C 5 mC, 5 hmC, biotina, DIG Sí + - Hemo KlenTaq nt nt 3´A 2 kb 68 °C Sí No - LongAmp® Polimerasas 2X 3´A/romo 30 kb 65 °C No Sí ++ *Fidelidad relativa a la ADN polimerasa Taq. Seguimos investigando ensayos para caracterizar la tasa de error muy baja de Q5 para garantizar que presentamos los datos de fidelidad más precisos posibles (Potapov, V y Ong, JL (2017) PloS ONE, 12(1): e0169774). **Las plantillas simples incluyen ADN genómico plasmídico, viral y de E. coli. Las plantillas complejas incluyen ADN genómico y ADNc de plantas, humanos y otros mamíferos. *** Para más información, contacte con el Soporte Técnico en info@neb.com. Para más información sobre las propiedades que le ayudarán a seleccionar una polimerasa para su aplicación, consulte nuestra Tabla de Selección de ADN Polimerasas. Más información Fidelidad y tasa de error. La fidelidad de una ADN polimerasa se define por su capacidad para replicar con precisión una plantilla, mientras que la tasa de error es la tasa de incorporación errónea de un nucleótido incorrectamente emparejado. La fidelidad es importante para aplicaciones en las que la secuencia de ADN debe ser correcta después de la amplificación. Para más información sobre cómo se mide la fidelidad, haga clic aquí. Extremos de producto y actividad de exonucleasa. Consulte la sección "Más información" en nuestras Preguntas frecuentes sobre extremos de producto de PCR y nuestras Preguntas frecuentes sobre actividad de exonucleasa para ADN polimerasas. P: ¿Cómo debo determinar la temperatura de annealing adecuada para mi reacción? R: La temperatura de annealing óptima (Ta) para un par de cebadores se puede determinar empíricamente mediante la ejecución de una PCR en gradiente. Utilice la calculadora de Tm de NEB para determinar la temperatura de annealing inicial para su par de cebadores y la polimerasa/tampón NEB que se utilizará. A diferencia de otras calculadoras, la calculadora de Tm de NEB considera los componentes del tampón que afectan las temperaturas de fusión y las observaciones empíricas al calcular la temperatura de annealing óptima. Otras calculadoras en línea pueden subestimar la mejor temperatura de annealing para la polimerasa Q5. Para obtener más información sobre el uso de una única temperatura de annealing (es decir, "universal"), consulte nuestra nota de aplicación: Temperatura de annealing universal en PCR y su impacto en los resultados de amplificación. Más información. Una PCR eficiente es un equilibrio dinámico de sustancias químicas y reactivos que promueven la interacción de un cebador específico con su complemento en el molde a la temperatura de annealing seleccionada. Si bien las temperaturas de annealing son valores constantes seleccionados por el científico, las temperaturas de fusión entre cada cebador y el molde pueden variar de un amplicón a otro. Definiciones. Nota: esta sección trata específicamente sobre el annealing de un cebador de oligonucleótidos a un molde de ADN. Durante el paso de desnaturalización de la PCR, la alta temperatura separa el dsADN molde en ssADN, revelando secuencias de nucleótidos complejas que permiten la hibridación (unión, hibridación, asociación) de un cebador oligonucleótido monocatenario complementario a una temperatura más baja. La temperatura de hibridación (TA) es la temperatura utilizada durante el paso de hibridación del cebador de una PCR, que depende de la temperatura de fusión del cebador. La temperatura de fusión (TM) de un cebador es la temperatura a la que el 50% del cebador está unido a su complemento perfecto y el 50% está libre en solución debido a la disociación ("fusión") de su complemento. ¿Por qué es importante usar la temperatura de hibridación correcta para una PCR exitosa? La temperatura de hibridación de una reacción suele ser inferior a la temperatura de fusión para garantizar la hibridación del cebador con el molde. Si la temperatura de hibridación es demasiado alta, el cebador no se hibridará con el molde y la amplificación no continuará. Si la temperatura de annealing es demasiado baja, puede ocurrir una unión no específica del cebador(es) a la plantilla o entre sí (dímeros de cebador), causando: Mayor probabilidad de formación de producto no específico. Disminución de la formación del producto deseado debido a condiciones de reacción ineficientes. Reactivos de PCR que influyen en la temperatura de fusión del cebador y la temperatura de annealing de la reacción Las temperaturas de fusión no son valores constantes en una PCR y están influenciadas por varios factores: Longitud del cebador y proporción de guanina y citosina en relación con adenina y timina (% contenido de GC) Dicta la cantidad de enlaces de hidrógeno entre el cebador y su complemento. Cuanto mayor sea el enlace de hidrógeno (mayor Tm) de un cebador a su plantilla, más energía se necesita para romper esos enlaces (mayor temperatura). Concentración del cebador La temperatura de fusión de los cebadores en una PCR está determinada por las especies de ADN en exceso molar, que deberían ser los cebadores. Magnesio y dNTPs La concentración libre de iones magnesio [Mg2+] determina la temperatura de fusión de un dúplex de ADN, pero el magnesio puede ser secuestrado por los reactantes y productos de la PCR. La carga positiva del magnesio quela los fosfatos cargados negativamente de los dNTPs, cebadores y ssADN. La reducción de las repulsiones electrostáticas (entre el cebador y los fosfatos del ssADN) aumenta la concentración del cebador de cationes monovalentes (Na+, K+). Los cationes monovalentes apoyan la estabilidad del dúplex de ADN, de forma similar a los iones magnesio. Los cationes monovalentes y los iones magnesio compiten por la unión al ADN. El aumento de la concentración de cationes monovalentes disminuye la unión del magnesio al ADN. P: ¿Cuál debería ser la concentración final del cebador en mi PCR? A: PRODUCTOS DE POLIMERASA CONCENTRACIÓN FINAL DE CEBADOR RECOMENDADA (CADA UNO) RANGO DE CONCENTRACIÓN FINAL DE CEBADOR (CADA UNO) Polimerasas Q5® 500 nM 200-1000 nM Polimerasas Phusion® 500 nM 200-1000 nM Polimerasas OneTaq® 200 nM 50-1000 nM Polimerasas Taq 200 nM 50-1000 nM Hemo KlenTaq 300 nM 50-1000 nM Polimerasas LongAmp® 400 nM 50-1000 nM Recomendamos una concentración final de cebador de 500 nM cuando se utilizan polimerasas Q5 y ​​Phusion debido a su alta actividad de exonucleasa 3´-5´. Recomendamos una concentración final de cebador de 200 nM al utilizar polimerasas basadas en Taq, como OneTaq y EpiMark®. Consulte los protocolos específicos en las páginas de los productos para obtener información sobre las recomendaciones de rango. Más información Las polimerasas de la familia B de Archaeal, como Q5 y ​​Phusion, poseen una potente actividad exonucleasa 3'-5', que puede digerir nucleótidos en el extremo 3' de los cebadores y aumentar la probabilidad de amplificación inespecífica. En comparación con las polimerasas de la familia A, como Taq y OneTaq, una mayor concentración final de cebador compensa estos efectos y promueve la formación de productos específicos. Generalmente, una PCR eficiente requiere proporciones óptimas de magnesio, otros iones y cebadores para promover la especificidad mediante la estabilización de las cargas negativas en la cadena principal de fosfato. Si bien la composición de las ADN polimerasas Q5 y ​​Phusion es exclusiva, sus tampones están optimizados para usar una concentración final de cebador de 500 nM. P: ¿Qué son las polimerasas Hot Start y WarmStart® y cuándo debo usarlas? A: Al configurar reacciones a temperatura ambiente fuera del hielo Cuando se observa una amplificación no específica ¿Qué significa Hot Start/Warm Start? Nuestras polimerasas Hot Start y WarmStart utilizan aptámeros que inhiben la actividad enzimática a temperatura ambiente, lo que desalienta la formación de productos no específicos. La presencia de estos aptámeros no altera la función enzimática central. La distinción entre Hot Start y WarmStart es que las enzimas Hot Start son termófilas mientras que las enzimas WarmStart® son mesófilas; el rango termodinámico de los aptámeros para las enzimas Hot Start y WarmStart es en gran medida similar. Los aptámeros son oligonucleótidos diseñados que se unen a una molécula diana específica a través de interacciones no covalentes e incluyen modificaciones específicas de nucleobases que pueden mejorar los perfiles de inhibición y/o reducir los efectos secundarios no deseados. El beneficio de la inhibición basada en aptámeros sobre otras tecnologías Hot Start (como los anticuerpos) es que no requieren un paso de activación y se unen reversiblemente de manera dependiente de la temperatura. NEB ofrece polimerasas con aptámeros para PCR de rutina, PCR de alta fidelidad, amplificación isotérmica y transcripción inversa. Estos aptámeros pueden dirigirse a diferentes funciones enzimáticas para diferentes polimerasas. Más información. ¿Por qué se denomina "Hot Start"? Al igual que muchas ADN polimerasas de la Familia A sin corrección de errores, la Taq Polimerasa posee la capacidad de añadir bases al extremo del ADNmc de forma independiente del molde, incluso a temperatura ambiente, y puede resultar en la adición de bases no específicas a los extremos de los cebadores de ADN en la reacción, lo que permite la hibridación inespecífica y reduce la especificidad general de la reacción. Por el contrario, a temperaturas más altas, la unión no específica se reduce a medida que la hibridación se vuelve más rigurosa. Los primeros métodos para mitigar la actividad no deseada a baja temperatura se centraban en la exclusión de componentes clave de la reacción hasta que se aumentaba la temperatura de reacción, que luego se podían añadir a la mezcla, desencadenando la reacción en condiciones más restrictivas y de alta temperatura. Lea nuestro artículo destacado, "Uso de aptámeros para controlar la actividad enzimática: Hot Start Taq y más allá", para ver datos que comparan la formación de productos para enzimas con y sin inhibición de la actividad basada en aptámeros.