New England Biolabs, M0538S, ADN polimerasa WarmStart® Bst 2.0

Este producto está disponible en Categorías relacionadas Amplificación isotérmica y aplicaciones de desplazamiento de cadena Amplificación por desplazamiento de cadena y mellado Enzima, Amplificación del genoma completo, Amplificación isotérmica mediada por bucle, Definición de unidad de especificación Una unidad se define como la cantidad de enzima que incorporará 25 nmol de dNTP en material insoluble en ácido en 30 minutos a 65 °C. Condiciones de reacción 1X Paquete de tampón de amplificación isotérmica Incubar a 65 °C 1X Paquete de tampón de amplificación isotérmica 20 mM Tris-HCl 10 mM (NH4)2SO4 50 mM KCl 2 mM MgSO4 0,1 % Tween® 20 (pH 8,8 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 10 mM Tris-HCl 50 mM KCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 50 % Glicerol 0,1 % Triton® X-100 pH 7,1 a 25 °C Inactivación por calor 80 °C durante 20 minutos Condiciones del ensayo de la unidad 50 mM KCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8,8), 10 mM MgCl2, 30 nM M13mp18 SS DNA, 70 Cebador de secuenciación M13 nM (–47) de 24 mer, 200 μM de dATP, 200 μM de dCTP, 200 μM de dGTP, 100 μM de dTTP, incluyendo [3H]-dTTP y 100 μg/ml de BSA. Preguntas frecuentes : P: ¿Se suministran las ADN polimerasas NEB con los dNTP? R: No, los dNTP deben pedirse por separado. Se pueden pedir como una mezcla práctica (mezcla de solución de desoxinucleótidos (dNTP) (NEB# N0447) con una concentración de 10 mM de cada desoxinucleótido) o como un conjunto de 4 tubos individuales (conjunto de solución de desoxinucleótidos (dNTP) (NEB# N0446) con una concentración de 100 mM de cada desoxinucleótido). P: ¿Se puede utilizar la ADN polimerasa Bst 2.0 en otros NEBuffers? R: Se observa una actividad óptima en el tampón de amplificación isotérmica y un rendimiento casi óptimo en el tampón de reacción ThermoPol™. La unidad se analiza en un tampón no óptimo, obtenido de la bibliografía. La enzima presenta una actividad del 25 % en el tampón NE 1 y del 100 % en los tampones 2, 3, 4 y EcoRI. Los tampones NE 1-4 deben complementarse con 0,1 % de Triton X-100, 0,1 % de Tween-20 o 100 µg/ml de BSA para obtener los mejores resultados. P: ¿Se puede utilizar la ADN polimerasa Bst 2.0® para hacer que el ADN se vuelva romo? R: Los salientes 5' (extremos cóncavos 3') se pueden rellenar, pero no se eliminarán porque la enzima carece de actividad exonucleasa. La ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) (NEB# M0210) es la enzima de elección para esta aplicación. P: ¿Se puede usar la ADN polimerasa Bst 2.0® para rellenar los salientes 3'? R: No, las ADN polimerasas no pueden rellenar los salientes 3'. Para crear extremos romos, se deben eliminar los salientes 3'. La ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) (NEB# M0210), la ADN polimerasa T4 (NEB# M0203) y la nucleasa de frijol mungo (NEB# M0250) son las mejores opciones para eliminar los salientes 3'. P: ¿Se puede usar la ADN polimerasa Bst 2.0® para eliminar los salientes 5'? R: No, las ADN polimerasas no pueden eliminar los salientes 5'. Utilice la nucleasa de frijol mungo (NEB# M0250) para eliminar los salientes 5'. P: ¿Se puede inactivar por calor la ADN polimerasa Bst 2.0®? R: Sí, caliéntela a 80 °C durante 20 minutos. P: ¿Se puede usar la ADN polimerasa Bst 2.0® en aplicaciones que requieren ciclado térmico? R: No, las temperaturas de reacción son demasiado altas para la estabilidad de la enzima. P: ¿Se puede iniciar la ADN polimerasa Bst 2.0® en una muesca del ADN? R: Sí, puede iniciar la síntesis de la cadena en una muesca utilizando el 3' OH como cebador. P: ¿Se puede usar la ADN polimerasa Bst 2.0® a temperaturas distintas de 65 °C? R: Sí, la enzima tiene las siguientes actividades: 10-15 % a 37 °C 30-50 % a 50 °C 100 % a 60-70 °C 30-50 % a 72 °C No se recomienda el uso de Bst 2.0 a temperaturas superiores a 72 °C porque se inactiva por calor. P: ¿Se puede usar la ADN polimerasa Bst 2.0® en reacciones de marcaje y de llenado parcial? R: Sí, el Fragmento Klenow (3'→5' exo-) (NEB n.° M0212) también se recomienda para estas aplicaciones. P: ¿Se puede diluir la ADN polimerasa Bst 2.0®? R: Sí, se puede diluir y almacenar en un tampón con 0,1 % de Triton X-100 o 100 μg/ml de BSA. El tampón recomendado es 50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 mM de EDTA, 1 mM de DTT, 0,1 % de Triton X-100 y 50 % de glicerol. También se puede usar el Diluyente A con albúmina r (NEB n.° B8532). P: ¿Tiene la ADN polimerasa Bst 2.0® una exonucleasa de corrección 3'→5' activa? R: No. P: ¿Incorpora la ADN polimerasa Bst 2.0® dUTP? R: Sí. La ADN polimerasa Bst 2.0® puede utilizarse con una mezcla de dUTP y dTTP o con la sustitución completa de dTTP por dUTP. El uso de dUTP al 100 % puede inhibir parcialmente las reacciones de Bst 2.0 (hasta el doble del tiempo umbral de amplificación), pero se mantiene un rendimiento estable. Referencia: Kuangwen Hsieh, Peter L. Mage, Andrew T. Csordas, Michael Eisenstein, H. Tom Soh. (2014). Eliminación simultánea de la contaminación por arrastre y detección de ADN con amplificación isotérmica mediada por bucle suplementada con uracil-ADN-glicosilasa (UDG-LAMP). Royal Society of Chemistry. PubdMedID: 24577617. P: ¿Dispone NEB de una mezcla maestra para reacciones LAMP o RT-LAMP? R: Sí. Ofrecemos varias opciones compatibles con los protocolos LAMP/RT-LAMP. El kit WarmStart® LAMP (ADN y ARN) (NEB n.° E1700) incluye un colorante fluorescente LAMP 50X para la detección fluorescente de reacciones LAMP/RT-LAMP. La mezcla maestra colorimétrica WarmStart LAMP 2X (ADN y ARN) (NEB n.° M1800) incluye un indicador colorimétrico basado en pH para la detección visual de reacciones LAMP/RT-LAMP (un cambio de color de rosa a amarillo indica amplificación). Las versiones actualizadas de ambos productos incluyen UDG termolábil y dUTP para reducir el riesgo de contaminación por arrastre (NEB n.° E1708 y NEB n.° M1804, respectivamente). Además, la mezcla maestra multiusos WarmStart LAMP/RT-LAMP 2X (con UDG) (NEB n.° M1708) es compatible con diferentes tipos de entrada de muestra y admite múltiples métodos de detección, incluido el azul de hidroxinaftol. Todas las mezclas maestras LAMP incluyen una combinación de transcriptasa inversa WarmStart RTx y ADN polimerasa Bst 2.0 WarmStart para una amplificación rápida y robusta de dianas de ADN y ARN. Cada mezcla requiere únicamente cebadores LAMP suministrados por el usuario y muestras de ADN o ARN diana. P: ¿Cómo uso la UDG termolábil antártica para la prevención de contaminación por arrastre en reacciones LAMP? R: La prevención de contaminación por arrastre requiere dos partes: la incorporación de dUTP por una ADN polimerasa durante la generación del amplicón, y la escisión de esos uracilos en los productos amplificados y la destrucción del amplicón catalizada por una UDG. Para LAMP, las reacciones deben ejecutarse con una inclusión de ~50% de dUTP mezclado con dTTP (p. ej., 1,4 mM de dATP, dCTP, dGTP, 0,7 mM de dTTP y dUTP) y debe usarse una ADN polimerasa Bst para la incorporación eficiente de dU sin inhibición significativa de la reacción. Para la posterior destrucción de productos contaminantes, se recomienda encarecidamente el UDG termolábil antártico en lugar del UDG de E. coli más termoestable. Incluya 0,5 μL de UDG termolábil antártico por cada 25 μL de reacción LAMP y simplemente configure y ejecute sus reacciones LAMP de forma normal. La actividad del UDG durante la configuración y el calentamiento a 65 °C destruirá de forma rápida y eficiente cualquier producto contaminante. Si se requiere una descontaminación más rigurosa, se pueden agregar 10 minutos a 25 °C al comienzo del flujo de trabajo. Para simplificar, se han incluido dUTP y UDG en una actualización: WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix con UDG y kit LAMP fluorescente WarmStart Fluorescent LAMP/RT-LAMP Kit (con UDG). P: ¿Cuáles son las principales causas de fallo de reacción utilizando la ADN polimerasa Bst 2.0®? R: Las temperaturas superiores a 72 °C pueden reducir significativamente la actividad enzimática. Además, si no se utiliza el tampón adecuado que contenga 0,1 % de Triton X -100, 0,1 % de Tween-20 o 100 μg/ml de BSA, la reacción puede fallar. Consulte la pregunta 3 anterior. P: ¿Qué son las polimerasas Hot Start y WarmStart® y cuándo debo utilizarlas? R: Al configurar reacciones a temperatura ambiente fuera del hielo Cuando se observa una amplificación no específica ¿Qué significa Hot Start/Walk Start? Nuestras polimerasas Hot Start y WarmStart utilizan aptámeros que inhiben la actividad enzimática a temperatura ambiente, lo que desalienta la formación de productos no específicos. La presencia de estos aptámeros no altera la función enzimática central. La distinción entre Hot Start y WarmStart es que las enzimas Hot Start son termófilas, mientras que las enzimas WarmStart® son mesófilas; el rango termodinámico de los aptámeros para las enzimas Hot Start y WarmStart es en gran medida similar. Los aptámeros son oligonucleótidos modificados que se unen a una molécula diana específica mediante interacciones no covalentes e incluyen modificaciones específicas de nucleobases que pueden mejorar los perfiles de inhibición o reducir los efectos secundarios no deseados. La ventaja de la inhibición basada en aptámeros, en comparación con otras tecnologías de inicio rápido (como los anticuerpos), es que no requieren un paso de activación y se unen de forma reversible, dependiente de la temperatura. NEB ofrece polimerasas con aptámeros para PCR de rutina, PCR de alta fidelidad, amplificación isotérmica y transcripción inversa. Estos aptámeros pueden dirigirse a diferentes funciones enzimáticas para diferentes polimerasas. Más información. ¿Por qué se denomina "inicio rápido"? Al igual que muchas ADN polimerasas de la Familia A sin corrección de errores, la Taq Polimerasa posee la capacidad de añadir bases al extremo del ADNmc de forma independiente del molde, incluso a temperatura ambiente, y puede resultar en la adición de bases no específicas a los extremos de los cebadores de ADN en la reacción, lo que permite la hibridación fuera de la diana y reduce la especificidad general de la reacción. Por el contrario, a temperaturas más altas, la unión inespecífica se reduce a medida que la hibridación se vuelve más rigurosa. Los primeros métodos para mitigar la actividad no deseada a baja temperatura se centraban en la exclusión de componentes clave de la reacción hasta que se aumentaba la temperatura de reacción, que luego se podían añadir a la mezcla, desencadenando la reacción en condiciones más restrictivas de alta temperatura. Lea nuestro artículo destacado, "Uso de aptámeros para controlar las actividades enzimáticas Hot Start Taq y más allá", para ver datos que comparan la formación de productos para enzimas con y sin inhibición de la actividad basada en aptámeros. P: ¿Qué son LAMP y RT-LAMP? R: La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) es un método de amplificación isotérmica diseñado para detectar un ácido nucleico diana sin necesidad de equipos sofisticados. Utiliza una ADN polimerasa con desplazamiento de soporte, como la ADN polimerasa Bst, y de 4 a 6 cebadores que reconocen de 6 a 8 regiones distintas del ADN diana para una reacción de amplificación altamente específica. LAMP proporciona una alta sensibilidad (hasta fg o <10 copias de la diana) con resultados rápidos: las reacciones se pueden realizar en tan solo 5 a 10 minutos. Las reacciones pueden realizarse con recursos limitados, utilizando un baño de agua para la incubación y la detección visual de los resultados, o con instrumentos de medición en tiempo real y de alto rendimiento. La detección de dianas de ARN se logra simplemente añadiendo una transcriptasa inversa a la reacción LAMP, con RT-LAMP como un flujo de trabajo isotérmico de un solo paso. La transcriptasa inversa WarmStart RTx (NEB n.° M0380) es una ADN polimerasa dirigida por ARN, acoplada a un aptámero de unión reversible que inhibe la actividad de RTx por debajo de 40 °C, lo que la hace especialmente adecuada para RT-LAMP. Para obtener más información y ver nuestra oferta de productos LAMP, visite la página de descripción general de aplicaciones LAMP. P: ¿Cuál es la diferencia entre la ADN polimerasa Bst, fragmento grande, Bst 2.0, Bst 3.0 y la ADN polimerasa Bst-XT? R: Las cuatro polimerasas son ADN polimerasas moderadamente termoestables con actividad de desplazamiento de cadena, lo que les permite realizar reacciones de amplificación isotérmicas como LAMP. La ADN polimerasa Bst 2.0 es un homólogo de la ADN polimerasa Bst de fragmento grande, diseñado in silico. Está diseñada para mejorar sus propiedades en reacciones LAMP, incluyendo tolerancia a la sal, termoestabilidad e incorporación de dUTP. La Bst 2.0 destaca por su alta especificidad. La Bst 3.0 ofrece algunas mejoras, especialmente una mayor velocidad de amplificación. La Bst 3.0 también ha mejorado su rendimiento en reacciones LAMP a temperaturas más altas (hasta 72 °C); sin embargo, para algunos objetivos, la Bst 3.0 no conserva la alta especificidad de la Bst 2.0. La Bst-XT combina las propiedades más deseables de la Bst 2.0 y la Bst 3.0. Ofrece la alta especificidad de la Bst 2.0 y la rápida velocidad de amplificación de la Bst 3.0. Además, la Bst-XT es activa en un rango de temperatura más amplio, lo que permite reacciones LAMP entre 50 y 70 °C. Bst-XT WarmStart NEB #M9204 Bst 2.0 WarmStart NEB #M0538 Bst 3.0 NEB #M0374 Velocidad de amplificación ★★★★★ ★★★★★ Especificidad ★★★★★ ★★★★★ ★★ ¿Configuración a temperatura ambiente? Habilitado Habilitado No recomendado Temperatura óptima de LAMP 50-70 °C 60-70 °C 55-72 °C Disponible sin glicerol Sí NEB #M9205 Sí NEB #M0402 Sí NEB #M0443 ★★★★★ = producto óptimo recomendado para la aplicación seleccionada ★★ o ★★★ = funcionará en la aplicación seleccionada ★ = puede funcionar pero no se recomienda P: ¿Cuándo debería ser la ADN polimerasa Bst 2.0® la enzima de elección? R: La ADN polimerasa Bst 2.0 muestra una alta actividad de desplazamiento de cadena. Llena un vacío entre las polimerasas termófilas y mesófilas. La temperatura óptima de 60-70 °C es mayor que la de la ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) (NEB n.º M0210) y menor que la de la ADN polimerasa Vent (NEB n.º M0254), otras dos polimerasas de desplazamiento de cadena. Esto proporciona a los investigadores un rango más amplio de condiciones de reacción para optimizar el desplazamiento de cadena y la hibridación de cebadores. Esto es útil en el diseño de estrategias de secuenciación, así como en tecnologías de amplificación isotérmica. La temperatura de reacción elevada facilita la secuenciación a través de regiones ricas en GC. P: ¿Por qué debería usar la ADN polimerasa Bst 2.0 WarmStart®? R: La ADN polimerasa Bst 2.0 WarmStart® ofrece todas las propiedades mejoradas de la ADN polimerasa Bst 2.0, con el beneficio adicional de la capacidad de configurar la reacción a temperatura ambiente. Las ADN polimerasas muestran actividad no deseada, no moldeada, a temperaturas inferiores a las temperaturas de amplificación establecidas, y esta actividad puede afectar significativamente el rendimiento y la reproducibilidad. El aptámero de Bst 2.0 WarmStart® inhibe la actividad de la ADN polimerasa por debajo de 45 °C y, por lo tanto, las reacciones pueden realizarse a temperatura ambiente.