New England Biolabs, M0544S, mezcla maestra NEBNext® Ultra™ II Q5®

Categorías relacionadas con NEBNext Ultra II Q5 Preparación de bibliotecas de ADN para Illumina, Análisis de metilación de ADN por conversión de bisulfito, Automatización para la preparación de bibliotecas NGS NEBNext®, Aplicaciones Preguntas frecuentes sobre PCR P: ¿Qué novedades hay sobre la mezcla maestra NEBNext Ultra II Q5? R: La mezcla maestra NEBNext Ultra II Q5 se ha optimizado para aumentar los rendimientos de PCR de las bibliotecas NGS, con un sesgo de GC mínimo. Su naturaleza de inicio en caliente basada en aptámeros la hace ideal para la automatización y es compatible con muchas perlas magnéticas carboxiladas, tosiladas y de estreptavidina que se utilizan a menudo en los flujos de trabajo NGS. P: ¿La mezcla maestra NEBNext Ultra II Q5 es un inicio en caliente? R: Sí, la mezcla maestra NEBNext Ultra II Q5 es un inicio en caliente. Puede configurar la reacción de PCR en hielo o a temperatura ambiente. P: ¿La mezcla maestra NEBNext Ultra II Q5 es la misma que la mezcla maestra Q5 Hot Start High-Fidelity 2X (M0494)? R: No. Aunque ambas mezclas maestras contienen la ADN polimerasa Q5 Hot Start de alta fidelidad, su composición es diferente. La mezcla maestra NEBNext Ultra II Q5 se ha optimizado específicamente para una amplificación robusta de bibliotecas NGS, mientras que la mezcla maestra Q5 Hot Start de alta fidelidad 2X se ha optimizado para la amplificación de diversas plantillas, incluyendo amplicones más largos. P: ¿Cuál es la diferencia entre la mezcla maestra NEBNext Ultra II Q5 y ​​la mezcla maestra NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR (M0543)? R: Aunque ambas mezclas maestras contienen la ADN polimerasa Q5 Hot Start de alta fidelidad, su composición es diferente. La mezcla maestra NEBNext Ultra II Q5 se ha optimizado específicamente para amplificar fielmente bibliotecas NGS con el mínimo sesgo de amplificación. Además, la mezcla maestra NEBNext Ultra II Q5 no precipita. Por el contrario, la mezcla maestra NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR a veces precipita y requiere una mezcla adicional. El número recomendado de ciclos de PCR varía según la formulación, por lo que es importante seguir las pautas de ciclado correctas. P: ¿Cuál es la diferencia entre la mezcla maestra NEBNext Ultra II Q5 y ​​la mezcla maestra NEBNext High-Fidelity 2X PCR (M0541)? R: Aunque ambas mezclas maestras contienen ADN polimerasa Q5 de alta fidelidad, su composición es diferente. La mezcla maestra NEBNext Ultra II Q5 se ha optimizado específicamente para amplificar fielmente bibliotecas NGS con el mínimo sesgo de amplificación. Además, la amplificación de bibliotecas NGS, tanto en presencia como en ausencia de microesferas magnéticas, es más robusta y ofrece un arranque en caliente, lo que la hace ideal para flujos de trabajo automatizados. P: ¿Qué condiciones de ciclado debo usar para la mezcla maestra NEBNext Ultra II Q5? R: Hemos optimizado las condiciones de ciclado para una amplificación robusta y con bajo sesgo de bibliotecas NGS. Recomendamos una temperatura de extensión de 65 °C para esta aplicación. Si utiliza cebadores distintos a los NEBNext, es posible que deba optimizar la temperatura de annealing. P: ¿Puedo aumentar el volumen de la reacción de PCR para aumentar el rendimiento de la biblioteca? R: Recomendamos un volumen de PCR de 50 μl. Aumentar la PCR simplemente no aumenta el rendimiento. Puede aumentar gradualmente el número de ciclos de PCR o la concentración de cebadores en una reacción de PCR de 50 μl para lograr mayores rendimientos. Tenga en cuenta que es común que las bibliotecas con rendimientos de 2 μg o superiores tiendan a mostrar un sesgo de amplificación. P: ¿Cuántos ciclos de PCR debo realizar con la mezcla maestra NEBNext Ultra II Q5? R: Depende de la cantidad de entrada. Para su uso con los kits NEBNext, consulte las directrices incluidas en la tarjeta de protocolo o con el protocolo del kit de biblioteca específico. P: ¿Puedo usar la mezcla maestra NEBNext Ultra II Q5 para amplificar ADN de baja calidad, como el ADN FFPE? R: Sí. Sin embargo, como con la mayoría de los productos, puede esperar un rendimiento menor con ADN muy dañado, como el ADN de muestras FFPE. P: ¿La mezcla maestra NEBNext Ultra II Q5 incorporará dUTP? R: No. La mezcla maestra NEBNext Ultra II Q5 no incorpora dUTP ni es compatible con ADN tratado con bisulfito. Para protocolos que emplean ADN tratado con bisulfito, se puede utilizar la mezcla maestra NEBNext(r) Q5U(r) (o la ADN polimerasa EpiMark™ Hot Start). P: ¿Puedo usar la mezcla maestra NEBNext Ultra II Q5 para amplificar bibliotecas convertidas con bisulfito? R: No. La mezcla maestra NEBNext Ultra II Q5 contiene una ADN polimerasa de tipo B que no tolera uracilo/dUTP. Por lo tanto, la mezcla maestra NEBNext Ultra II Q5 no es compatible con ADN convertido con bisulfito ni con dUTP. Para protocolos que emplean ADN tratado con bisulfito, se puede utilizar la ADN polimerasa EpiMark™ Hot Start. P: ¿Los productos de ADN producidos por la mezcla maestra NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR tienen extremos romos o una sola base saliente en el extremo 3'? R: Al igual que todos los productos Q5, la mezcla maestra NEBNext Ultra II Q5 produce extremos romos. P: ¿Es compatible la mezcla maestra NEBNext Ultra II Q5 con las microesferas que se utilizan habitualmente en los flujos de trabajo de NGS? R: Sí, las reacciones de PCR con la mezcla maestra NEBNext Ultra II Q5 pueden prepararse en presencia de diversas microesferas carboxiladas o tosiladas que se utilizan en los flujos de trabajo típicos de NGS, incluyendo microesferas AMPure y microesferas de estreptavidina. P: ¿Puedo usar la mezcla maestra NEBNext Ultra II Q5 para realizar experimentos sencillos de PCR de punto final? R: Sí. También ofrecemos otra mezcla maestra Q5, la M0494, optimizada para la PCR de punto final típica. Si utiliza la mezcla maestra NEBNext Ultra II Q5 para la PCR de punto final típica, recomendamos usar las condiciones de ciclado de la M0494, que tiene una temperatura de extensión de 72 °C. Puede encontrar más información aquí.