New England Biolabs, M0551S, ARN polimerasa de E. coli, holoenzima

La ARN polimerasa, holoenzima, es la enzima principal saturada con el factor sigma 70. La holoenzima inicia la síntesis de ARN a partir de promotores bacterianos y fágicos específicos de sigma 70. Categorías relacionadas: Modificación de ARN, Síntesis de ARN, Transcripción in vitro (IVT), Soluciones de nucleótidos para ARN. Unidad de especificación : Definición. Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para incorporar 1 nmol de NTP al ARN en 10 minutos a 37 °C. Condiciones de reacción 1X tampón de reacción de ARN polimerasa de E. coli Incubar a 37 °C 1X tampón de reacción de ARN polimerasa de E. coli 40 mM Tris-HCl 150 mM KCl 10 mM MgCl2 1 mM DTT 0,01 % Triton® X-100 (pH 7,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 20 mM Tris-HCl 100 mM NaCl 0,1 mM EDTA 1 mM DTT 50 % glicerol pH 7,5 a 25 °C Condiciones de ensayo de la unidad 1X tampón de reacción de ARN polimerasa de E. coli, suplementado con 0,5 mM de cada NTP y 1 μg de ADN del fago T7 en 50 μl. Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la diferencia entre la ARN polimerasa de E. coli, la enzima central y la holoenzima? A: La enzima central de la ARN polimerasa de E. coli consta de 5 subunidades designadas α, α, β', β y ω. La enzima no contiene el factor sigma y no inicia la transcripción específica a partir de promotores de ADN bacteriano y fágico. La enzima conserva la capacidad de transcribir ARN a partir de secuencias de iniciación no específicas. La adición de factores sigma permitirá que la enzima inicie la síntesis de ARN a partir de promotores bacterianos y fágicos específicos. La enzima central tiene un peso molecular de aproximadamente 400 kDa. La holoenzima de la ARN polimerasa de E. coli es la enzima central saturada con el factor sigma 70. La holoenzima inicia la síntesis de ARN a partir de promotores bacterianos y fágicos específicos de sigma 70. P: ¿Cuáles son las principales funciones de estas subunidades? R: Las principales funciones de las subunidades son: La subunidad β' contiene parte del centro activo responsable de la síntesis de ARN. La subunidad β contiene el resto del centro activo responsable de la síntesis de ARN. La subunidad α está presente en dos copias por molécula de ARN polimerasa. La subunidad α contiene determinantes para el ensamblaje de la ARN polimerasa y para las interacciones con factores reguladores. La pequeña subunidad ω facilita el ensamblaje de la ARN polimerasa y la estabiliza una vez ensamblada. Los factores sigma, al asociarse con la enzima core, aumentan la especificidad de sus promotores y permiten que la transcripción se inicie en los sitios correctos. P: ¿Se pueden usar la enzima core y la holoenzima en PURExpress? R: Sí. Si su gen tiene un promotor sigma 70 potente, se puede traducir en PURExpress añadiendo la holoenzima a la reacción. Si su gen está bajo el control de otros factores sigma, debe usar la enzima core y el factor sigma específico. NEB ha utilizado con éxito el factor sigma 54 y la enzima core en PURExpress. P: ¿Qué otros factores sigma hay en E. coli? R: Además del factor sigma 70, que desempeña un papel fundamental en la gestión de la flora intestinal, otros factores sigma en E. coli incluyen: σ19 (FecI): el factor sigma del citrato férrico, que regula el gen fec para el transporte de hierro; σ24 (RpoE): el factor sigma de estrés térmico extracitoplasmático/extremo; σ28 (RpoF): el factor sigma flagelar; σ32 (RpoH): el factor sigma de choque térmico, que se activa al exponerse al calor; σ38 (RpoS): el factor sigma de inanición/fase estacionaria; σ54 (RpoN): el factor sigma de limitación de nitrógeno.