New England Biolabs, M0554S, mezcla de enzimas KLD

Categorías relacionadas Kits de ensamblaje, clonación y mutagénesis de ADN Aplicaciones Mutagénesis dirigida al sitio, Mutagénesis dirigida al sitio, Soluciones de clonación y automatización de alto rendimiento Especificación Materiales necesarios pero no suministrados Agua libre de nucleasas (NEB n.º B1500) Preguntas frecuentes P: ¿La mezcla KLD (NEB n.º M0554) es el mismo producto que el componente de los kits de mutagénesis dirigida al sitio Q5 (E0554S y E0552S)? R: Sí. La mezcla KLD es el mismo producto que el componente KLD en los kits de mutagénesis dirigida al sitio Q5. P: ¿Qué polimerasas se pueden usar para amplificar los fragmentos que serán fosforilados y ligados por la mezcla KLD? R: La mezcla KLD se debe usar con fragmentos que se han amplificado con la polimerasa de alta fidelidad Q5 o la polimerasa de alta fidelidad Phusion. Este producto no es adecuado para amplicones con salientes 3' (p. ej., amplicones Taq). No recomendamos el uso de este producto en fragmentos de ADN que hayan sido amplificados por otras polimerasas. P: ¿Necesito purificar mis fragmentos amplificados por PCR antes o después del tratamiento con la mezcla KLD? R: No. La purificación de los fragmentos amplificados por PCR no es necesaria. P: ¿Qué es la mezcla KLD? R: La mezcla KLD contiene una mezcla de enzimas quinasa, ligasa y DpnI en un tampón que preserva la actividad de las enzimas. Esta formulación permite una fosforilación eficiente, una ligadura/circularización intramolecular y la eliminación de la plantilla en un solo paso de reacción de 5 minutos a temperatura ambiente. P: Si duplico el tamaño de mi PCR, ¿debería agregar más mezcla de PCR a la reacción KLD? R: No. La mezcla de enzimas KLD 10X está formulada para funcionar bien con 1 μl de la mezcla de PCR, independientemente del volumen de la PCR. P: ¿Puedo usar más de 5 μl de la reacción KLD para transformar E. coli? R: No. Si se necesitan más de 5 μl de la reacción KLD, se debe incluir un paso de intercambio de tampón, como la purificación por PCR, antes de la transformación. P: ¿Se puede incubar la reacción KLD durante más tiempo o a mayor temperatura? R: La reacción KLD se puede incubar hasta 60 minutos a temperatura ambiente. Como alternativa, para aumentar la eficiencia de la digestión con DpnI, la reacción KLD se puede incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos, seguidos de 30-60 minutos a 37 °C. La incubación a temperatura ambiente es esencial para la actividad de las enzimas quinasa y ligasa. P: Utilizo el kit de mutagénesis dirigida Q5 para introducir mutaciones individuales. ¿Cómo puedo introducir múltiples mutaciones? R: NEB® ha desarrollado un protocolo que utiliza la mezcla maestra de ensamblaje de ADN NEBuilder HiFi para simplificar la construcción de múltiples mutagénesis dirigidas. La técnica implica el diseño de cebadores flanqueadores complementarios para alinear fragmentos. Esta nota de aplicación describe el uso de la mezcla maestra de ensamblaje de ADN NEBuilder HiFi para generar múltiples mutagénesis dirigidas simultáneamente. Recomendamos solapamientos de 18-20 nt, pero la longitud de los cebadores puede variar. Los cebadores se solapan completamente, como se ilustra a continuación. El objetivo es lograr Ta equilibradas para los pares de cebadores. Las mutaciones se ubican en el centro del cebador. Debe haber suficientes bases a ambos lados, y sobre todo en el extremo 3' de la mutación, para que el cebador se asocie correctamente al molde.