New England Biolabs, M0568S, Exonucleasa I termolábil

¿Te interesa un protocolo de 5 minutos? Prueba Exo-CIP. Categorías relacionadas: Exonucleasas y endonucleasas no específicas. Especificación: Unidad. Definición: Una unidad de exonucleasa I termolábil se define como la cantidad de enzima que cataliza la liberación de 2 nmol de nucleótido soluble en ácido en un volumen total de reacción de 100 μl en 6 minutos a 37 °C en 50 mM de Tris-HCl (pH 7,9), 100 mM de NaCl, 10 mM de MgCl₂ y 100 μg/ml de BSA con 0,17 mg/ml de ADN monocatenario de E. coli [3H]-. Condiciones de reacción 1X NEBuffer™ r3.1 Incubar a 37 °C 1X NEBuffer™ r3.1 100 mM NaCl 50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 100 µg/ml Albúmina recombinante (pH 7,9 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 10 mM Tris-HCl 0,1 mM EDTA 1 mM DTT 0,25 M NaCl 50 % Glicerol 200 µg/ml BSA pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 80 °C durante 1 minuto Condiciones del ensayo de la unidad 50 mM Tris-HCl (pH 7,9), 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 100 μg/ml BSA y 0,17 mg/ml ADN monocatenario de E. coli [3H]-. Preguntas frecuentes : P: ¿Cómo puedo eliminar los cebadores y dNTP restantes de una reacción de PCR antes de la secuenciación de ADN? R: En un protocolo típico, se pueden mezclar 5 µl de reacción de PCR (de 30 a 35 ciclos de PCR), 1 µl de exonucleasa termolábil I y 1 µl de Quick CIP (sin necesidad de añadir el tampón rCutSmart), seguido de una incubación a 37 °C durante 4 minutos y, posteriormente, a 80 °C durante 1 minuto para inactivar la enzima. Conserve la muestra de limpieza a -20 °C antes de la secuenciación. Utilice 3 µl del producto de limpieza para la secuenciación con base de Sanger. P: ¿Puede la exonucleasa termolábil I eliminar cebadores en reacciones de PCR anidadas? R: Sí, añada 1 µl de exonucleasa termolábil I a la primera ronda de productos de PCR (hasta 20 µl) e incube la reacción a 37 °C durante 10 minutos, seguido de 80 °C durante 1 minuto para inactivar la enzima. A continuación, se pueden añadir nuevos conjuntos de cebadores y, a continuación, realizar una segunda ronda de PCR para reducir los amplicones de PCR inespecíficos. P: ¿La exonucleasa termolábil I degrada el ARN? R: No, el ARN no es un sustrato para la exonucleasa termolábil I cuando se utiliza según las recomendaciones. P: ¿Se puede utilizar la exonucleasa termolábil I para hacer romos el ADNdc? R: No. Los extremos cortos del ADNmc no son un sustrato. Utilice la ADN polimerasa I, fragmento Klenow grande (NEB n.º M0210) para rellenar los salientes de 5′ y reducir los salientes de 3′, o utilice la nucleasa de frijol mungo (NEB n.º M0250) para reducir los salientes de 3′ o 5′. Nota: Los salientes de 3′ no se pueden rellenar. P: ¿Se puede inactivar por calor la exonucleasa termolábil I? R: Sí. Inactive la enzima por calor a 80 °C durante 1 minuto, a 65 °C durante 5 minutos o a 60 °C durante 15 minutos. P: ¿Se puede utilizar la exonucleasa termolábil I con una exonucleasa bicatenaria para limpiar preparaciones de plásmidos? R: No se recomienda. La mejor enzima para limpiar la contaminación de ADN genómico en preparaciones de plásmidos es la exonucleasa V (recBCD, NEB n.º M0345). P: ¿La exonucleasa termolábil I funcionará en otros tampones? A: Sí, la incubación durante 4 minutos a 37 °C en los siguientes tampones resultó en la eliminación de > 95 % de oligos (20 pmol de ssDNA de 20 meros): Tampones % de oligos eliminados Tampón de reacción Taq estándar > 95 % Tampón de reacción Taq LongAmp® > 95 % Tampón de reacción estándar OneTaq® > 95 % Tampón de amplificación isotérmica > 95 % Tampón de reacción Thermopol > 95 % Tampón de reacción Taq Hot Start Epimark® > 95 % Tampón de reacción Q5® > 95 % Tampón AmpliTaq® 360 (Gold) > 95 % Tampón Phusion® HF > 95 % Tampón de reacción Green GoTaq® > 95 % Tampón NEBuffer® r1.1 > 95 % Tampón NEBuffer r2.1 > 95 % Tampón NEBuffer r3.1 > 95 % rCutSmartTM Tampón > 95 % P: ¿Se puede usar la Exonucleasa I con una exonucleasa bicatenaria para purificar preparaciones de plásmidos? R: La Exonucleasa I se puede usar con la Exonucleasa Lambda (NEB# M0262) para purificar preparaciones de plásmidos. La Exonucleasa III (NEB# M0206) y la Exonucleasa T7 (NEB# M0263) también funcionan, pero dañarán los plásmidos con cortes. Aunque se puede usar la exonucleasa I, recomendamos usar la exonucleasa V (RecBCD) (NEB n.° M0345) para eliminar el ADN cromosómico después de la preparación del plásmido (consulte nuestra Nota de aplicación: Uso de la exonucleasa V (RecBCD) para eliminar el ADN genómico residual al purificar plásmidos de baja copia con el kit Monarch® Plasmid Miniprep). P: ¿Puede contarme más sobre el cambio de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en NEBuffers? R: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción que contienen BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) a tampones que contienen albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de cambiar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan rAlbúmina. Creemos que Alejarse de los productos que contienen ingredientes de origen animal es un paso en la dirección correcta y poder ofrecer esta mejora al mismo precio.