New England Biolabs, M0578L, Q5 Quick-Load™ Mezcla maestra 2X de alta fidelidad

Categorías relacionadas: Mezclas maestras, PCR, qPCR y tecnologías de amplificación , Aplicaciones , PCR de alta fidelidad, Amplificación de ADN, PCR y qPCR, Especificaciones de PCR, Materiales necesarios (no suministrados), Tubos de PCR para termociclador, Preguntas frecuentes : P: ¿Cómo debo determinar la temperatura de annealing adecuada para mi reacción? R: La temperatura de annealing óptima (Ta) para un par de cebadores se puede determinar empíricamente mediante una PCR en gradiente. Utilice la calculadora de Tm de NEB para determinar la temperatura de annealing inicial para su par de cebadores y la polimerasa/tampón NEB que se utilizará. A diferencia de otras calculadoras, la calculadora de Tm de NEB tiene en cuenta los componentes del tampón que afectan las temperaturas de fusión y las observaciones empíricas al calcular la temperatura de annealing óptima. Otras calculadoras en línea pueden subestimar la mejor temperatura de annealing para la polimerasa Q5. Para obtener más información sobre el uso de una temperatura de annealing única (es decir, "universal"), consulte nuestra nota de aplicación: Temperatura de annealing universal en PCR y su impacto en los resultados de amplificación. Más información La PCR eficiente es un equilibrio dinámico de sustancias químicas y reactivos que promueven la interacción de un cebador específico con su complemento en la plantilla a la temperatura de annealing seleccionada. Si bien las temperaturas de annealing son valores constantes seleccionados por el científico, las temperaturas de fusión entre cada cebador y la plantilla pueden variar de un amplicón a otro. Definiciones Nota: esta sección trata específicamente el annealing de un cebador oligonucleotídico a una plantilla de ADN. Durante el paso de desnaturalización de la PCR, la alta temperatura separa el dsADN plantilla en ssADN, revelando secuencias de nucleótidos complejas que permiten el annealing (unión, hibridación, asociación) de un cebador oligonucleotídico monocatenario complementario a una temperatura más baja. La temperatura de annealing (TA) es la temperatura utilizada durante el paso de annealing del cebador de una PCR, que depende de la temperatura de fusión del cebador. La temperatura de fusión (TM) de un cebador es la temperatura a la que el 50 % del cebador está unido a su complemento perfecto y el 50 % está libre en solución debido a la disociación ("fusión") de su complemento. Por qué usar la temperatura de annealing correcta es importante para una PCR exitosa La temperatura de annealing de una reacción usualmente es menor que la temperatura de fusión para asegurar la hibridación del cebador con la plantilla. Si la temperatura de annealing es demasiado alta, el cebador no se annealizará con la plantilla y la amplificación no procederá. Si la temperatura de annealing es demasiado baja, puede ocurrir una unión no específica del cebador(es) con la plantilla o entre sí (dímeros de cebador), causando: Mayor probabilidad de formación de producto no específico. Disminución de la formación del producto deseado debido a condiciones de reacción ineficientes. Reactivos de PCR que influyen en la temperatura de fusión del cebador y la temperatura de annealing de la reacción Las temperaturas de fusión no son valores constantes en una PCR y están influenciadas por una serie de factores: Longitud del cebador y proporción de guanina y citosina en relación con adenina y timina (% contenido de GC) Dicta la cantidad de enlaces de hidrógeno entre el cebador y su complemento. Cuanto mayor sea el enlace de hidrógeno (mayor Tm) de un cebador con su plantilla, más energía se necesita para romper esos enlaces (mayor temperatura). Concentración de cebadores La temperatura de fusión de los cebadores en una PCR está determinada por las especies de ADN en exceso molar, que deberían ser los cebadores. Magnesio y dNTPs La concentración libre de iones magnesio [Mg2+] determina la temperatura de fusión de un dúplex de ADN, pero el magnesio puede ser secuestrado por los reactantes y productos de la PCR. La carga positiva del magnesio quela los fosfatos cargados negativamente de los dNTP, cebadores y ssDNA. La reducción de las repulsiones electrostáticas (entre el cebador y los fosfatos del ssDNA) aumenta la concentración del cebador de cationes monovalentes (Na+, K+) Los cationes monovalentes apoyan la estabilidad del dúplex de ADN, de forma similar a los iones magnesio. Los cationes monovalentes y los iones magnesio compiten por la unión al ADN. El aumento de la concentración de cationes monovalentes disminuye la unión del magnesio al ADN. P: ¿Cuál es la ventaja de usar Q5 Quick-Load™? R: Los productos Q5 Quick-Load™ permiten la carga directa del producto de PCR en geles de ADN, manteniendo el mismo rendimiento que otras mezclas maestras Q5. Además, Q5 Quick-Load simplifica los pasos experimentales y reduce los consumibles de laboratorio utilizados para preparar la electroforesis en gel (p. ej., puntas, placas). P: ¿Qué colorantes contiene Q5 Quick-Load™? R: Los productos Q5 Quick-Load contienen dos colorantes distintos (amarillo y azul) que cumplen una doble función de monitorización durante la electroforesis. El colorante azul comigra con fragmentos de ADN de 3-5 kb en un gel de agarosa al 1%. El colorante amarillo migra por delante de los fragmentos de ADN que miden menos de 50 pb, lo que permite una monitorización y evaluación eficientes de fragmentos de ADN más pequeños, incluidos los cebadores. Los colorantes azul y amarillo tienen picos de excitación a 615 nm y 421 nm, respectivamente. P: ¿Los colorantes de seguimiento presentes en Q5 Quick-Load™ interfieren con las aplicaciones posteriores? R: Los productos Q5 Quick-Load contienen dos colorantes distintos (amarillo y azul) compatibles con aplicaciones posteriores, como la secuenciación de ADN, la ligadura y la digestión por restricción. Para aplicaciones que requieran el análisis de productos de PCR por absorbancia o fluorescencia, recomendamos utilizar versiones incoloras de los productos (NEB n.° M0492 y NEB n.° M0494) o purificar previamente los productos de PCR. Para esta tarea, se recomienda el kit Monarch PCR & DNA Cleanup (NEB n.° T1130), ya que elimina el colorante y deja el ADN intacto para su posterior análisis. También se recomienda el kit Exo-CIP™ Rapid PCR Cleanup (NEB n.° E1050) para una limpieza eficiente de las reacciones de PCR.