New England Biolabs, M0603S, Metiltransferasa EcoGII

Disponible en mayor concentración. Categorías relacionadas: Metiltransferasas para epigenética, Enzimas modificadoras de bases. Unidad de especificación. Definición: Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para proteger 100 ng de dsADN marcado con FAM durante 30 minutos a 37 °C en un volumen total de reacción de 20 μl contra la escisión por la endonucleasa de restricción MboI. Condiciones de reacción Suplemento de tampón rCutSmart™ 1X con 160 µM de S-adenosilmetionina (SAM) Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM NaCl 250 mM DTT 1 mM EDTA 0,15 % Triton® X-100 180 µg/ml de BSA Glicerol al 50 % pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 10 minutos Condiciones del ensayo de la unidad La metiltransferasa EcoGII se incuba con 100 ng de una Sustrato de dsADN marcado con FAM (80 pb) en 20 μl de tampón rCutSmart 1X suplementado con 160 µM de SAM, durante 30 minutos a 37 °C, seguido de 10 minutos a 65 °C. El grado de protección se determina mediante la adición de 5 unidades de la endonucleasa de restricción MboI (incubación a 37 °C durante 30 minutos, 65 °C durante 20 minutos), seguida de un análisis por electroforesis capilar para resolver los productos de reacción, asignar las especies escindidas y no escindidas, y cuantificar su abundancia. Preguntas frecuentes : P: ¿Funcionan las metiltransferasas NEB (metilasas) en el ARN? R: Sí, la metiltransferasa EcoGII (NEB n.° M0603) produce entre un 5 % y un 10 % de residuos de adenosina metilados en sustratos de ARN. Sin embargo, otras metiltransferasas no lo hacen. Tenga en cuenta: NEB ha probado las siguientes transferasas/metilasas (MT): dam metiltransferasa (NEB #M0222), AluI metiltransferasa (NEB #M0220), BamHI metiltransferasa (NEB #M0223), M.SssI metiltransferasa (NEB #M0226), EcoRI metiltransferasa (NEB #M0211), M.CviPI metiltransferasa (NEB #M0227), HaeIII metiltransferasa (NEB #M0224), HhaI metiltransferasa (NEB #M0217), HpaII metiltransferasa (NEB #M0214), MspI metiltransferasa (NEB #M0215) y TaqI metiltransferasa (NEB #M0219) utilizando sus tampones de reacción suministrados en dos sustratos: 1) Un ARNm transcrito in vitro que codifica la luciferasa de luciérnaga (1 µg) y 2) ARN HeLa total (250 ng). Cada sustrato se incubó con dos cantidades de enzima (1 y 5 µl) durante 1 hora a 37 °C (65 °C para Taq I MT), se purificó mediante una columna de centrifugación, se digirió hasta nucleósidos individuales mediante una mezcla de enzimas y se analizó por LC/MS para identificar residuos modificados y no modificados. Ninguna de las metilasas examinadas logró transferir un grupo metilo a los sustratos de ARN examinados. P: ¿Cuál es la actividad de la EcoGII metiltransferasa a temperaturas distintas de 37 °C? A: 4 °C = 25 % 16 °C = 25 % 25 °C = 50 % 30 °C = 100 % 37 °C = 100 % 42 °C = 100 % 50 °C = 50 % P: ¿Se suministra S-adenosilmetionina (SAM) con la metiltransferasa? R: Sí, se proporciona una solución madre a 32 mM. También se puede pedir por separado como producto NEB n.º B9003S. La SAM es el componente más lábil de la reacción. Si la solución madre tiene más de 9 meses, debe reemplazarse. P: ¿La EcoGII metiltransferasa requiere BSA? R: No, la EcoGII metiltransferasa no requiere BSA ni albúmina recombinante (rAlbúmina). P: ¿La EcoGII metiltransferasa requiere MgCl2? R: No, la EcoGII metiltransferasa no requiere MgCl2. P: ¿Cuál es la actividad de la EcoGII metiltransferasa en otros tampones? R: Buffer NE r1.1 = 75 % Buffer NE r2.1 = 100 % Buffer NE r3.1 = 50 % Buffer rCutSmart = 100 % P: ¿Cuál es el peso molecular de la EcoGII metiltransferasa? R: El peso molecular es de 40 151 daltons. P: ¿Se puede inactivar la EcoGII metiltransferasa por calor? R: Sí, inactivar por calor a 65 °C durante 10 min. P: ¿Es la EcoGII metiltransferasa sensible a la sal? R: Sí, la EcoGII metiltransferasa es sensible a la sal. Asegúrese de que la solución de ADN tenga una baja concentración de sal o que represente solo un pequeño porcentaje del volumen final de la reacción. Si la sal es un problema, reduzca la concentración de sal mediante diálisis por goteo. P: ¿Metilizará la EcoGII metiltransferasa el ssADN? R: Sí, la EcoGII metiltransferasa metilará las desoxiadenosinas presentes en las moléculas de ADNmc. P: ¿La EcoGII metiltransferasa metilará híbridos de ADN/ARN? R: Aunque los residuos de adenina presentes en la cadena de ARN pueden modificarse, la EcoGII metiltransferasa modificará preferentemente los residuos de adenina presentes en la cadena de ADN de una molécula híbrida de ADN/ARN. Consulte la tabla en la página de descripción del producto para obtener más detalles sobre los niveles de metilación de varios sustratos por la EcoGII metiltransferasa. P: ¿La EcoGII metiltransferasa metilará ADNg? R: Sí, la EcoGII metiltransferasa metilará ADN genómico. Consulte la tabla en la página de descripción del producto para obtener más detalles sobre los niveles de metilación de varios sustratos por la EcoGII metiltransferasa. P: ¿La EcoGII metiltransferasa metilará ARN? R: Sí, la EcoGII metiltransferasa metilará la adenina presente en las moléculas de ARN, sin embargo, en menor medida que el ADN. Consulte la tabla en la página de descripción del producto para obtener más detalles sobre los niveles de metilación de varios sustratos por la EcoGII metiltransferasa. P: ¿La metilación de EcoGII bloqueará las enzimas de restricción? R: La metilación por la EcoGII metiltransferasa bloqueará muchas endonucleasas de restricción que reconocen secuencias que contienen bases dA. Consulte la tabla en la página de descripción del producto para obtener más detalles sobre los niveles de metilación de varios sustratos por la EcoGII metiltransferasa. P: ¿Cómo puedo aumentar la metilación de mi sustrato por la EcoGII metiltransferasa? R: SAM es inestable a pH 7,5, 37 °C. Para reacciones prolongadas, agregar más SAM después de 4 horas puede mejorar los resultados. Sin embargo, las reacciones de metilación también se ven muy afectadas por la S-adenosilhomocisteína. La S-adenosilhomocisteína, subproducto de la reacción de metilación, se une con mayor fuerza a las metilasas que la SAM. La inhibición por la S-adenosilhomocisteína reduce considerablemente la velocidad de reacción con el tiempo. Consulte la tabla en la página de descripción del producto para obtener más detalles sobre los niveles de metilación de varios sustratos por la EcoGII metiltransferasa. P: ¿Puedo comprar grandes cantidades de una enzima para la innovación ya existente? R: Sí, si necesita grandes cantidades de una enzima para la innovación, póngase en contacto con NEB en EnzymesForInnovation@neb.com. Tenga en cuenta que la disponibilidad puede ser limitada y, por lo tanto, se requieren plazos de entrega más largos para pedidos grandes. También podrían ser necesarias pruebas de control de calidad adicionales para satisfacer su aplicación y necesidades específicas. P: ¿Qué son las enzimas para la innovación? R: Enzimas para la Innovación (EFI) es un proyecto iniciado por NEB para proporcionar enzimas únicas a la comunidad científica con la esperanza de facilitar el descubrimiento de aplicaciones nuevas e innovadoras. Estas enzimas poseen propiedades interesantes y especificidades únicas que no están disponibles comercialmente en otros lugares con la calidad que se esperaría de NEB. Las enzimas graduadas de Enzimas para la Innovación son enzimas que han pasado de tener aplicaciones desconocidas o exploratorias a convertirse en la piedra angular de una aplicación definida. Si tiene una idea para una "Enzima para la Innovación" con una aplicación sugerida que pueda ser útil, envíenos un correo electrónico a EnzymesForInnovation@neb.com. Para obtener más información, vea el video. P: ¿Puede contarme más sobre la transición de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NEBuffer? R: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción que contienen BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) a tampones que contienen albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan albúmina recombinante. Creemos que dejar de usar productos de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.