New England Biolabs, M0608S, enzima de descapuchado de ARNm

Enzima de descapuchado de ARNm descapucha m Categorías relacionadas Especificación de modificación de ARN Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima de descapuchado de ARNm necesaria para convertir el 50 % de un sustrato con tapón de 500 nM m 7 G en una forma 5'-monofosforilada en un volumen de reacción total de 20 μl en 1 hora a 37 °C. Condiciones de reacción 1X tampón de reacción de enzima de descapsulado de ARNm Incubar a 37 °C 1X tampón de reacción de enzima de descapsulado de ARNm 50 mM Tris-HCl 50 mM Cloruro de amonio 5 mM MgCl2 1 mM DTT 0,1 % Poloxámero 188 (pH 7,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 300 mM NaCl 10 mM Tris-HCl 0,1 mM DTT 50 % Glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor No Preguntas frecuentes P: ¿La enzima de descapsulado de ARNm elimina los 5′ trifosfatos? R: Sí, aunque con menor eficiencia. En condiciones de reacción de ensayo unitario, se requirió 10 veces más enzima para lograr una conversión del 10% de un sustrato de ARN trifosforilado de 25 nucleótidos a la forma monofosfato que la requerida para descapsular completamente el mismo sustrato de 25 nucleótidos con una tapa. Un exceso de 100 veces de enzima solo logró una conversión del 50%. Para la conversión de trifosfato a monofosfato, RppH (NEB #M0356) es una opción superior. P: ¿La actividad de la enzima de descapsulado de ARNm es sensible a la estructura secundaria del ARN? R: Sí. Los extremos 5' hundido o romos se descapsulan de forma menos eficiente que los extremos monocatenarios o que sobresalen en 5'. Sin embargo, la interferencia estructural se puede superar mediante el uso de más enzima, temperaturas de incubación más altas o tiempos de incubación más prolongados. P: ¿La enzima de descapsulado de ARNm tiene preferencia por ARN más largos o más cortos? R: La enzima de descapsulado de ARNm no ha mostrado preferencias obvias por ARN largo o corto. Cuando los moles de extremos de ARN son iguales, tanto un ARN de 25 nucleótidos como uno de 1,7 kb se descapsulan con la misma eficiencia. P: ¿Es activa la enzima de descapsulado de ARNm en otros tampones de reacción NEB? R: La enzima de descapsulado de ARNm tiene una actividad de ~50 % en el tampón rCutSmart®, el tampón NEBuffer r1.1 y el tampón ThermoPol™. P: ¿Requiere la enzima de descapsulado de ARNm la presencia de metales para su actividad? R: Sí, se requiere magnesio para la actividad de descapsulado. P: ¿Es activa la enzima de descapsulado de ARNm a temperaturas más altas? R: Sí. La actividad de descapsulado completa se observa hasta 45 °C, y se observa una actividad reducida >50 % hasta 55 °C. Se debe tener cuidado de reducir los tiempos de incubación a temperaturas elevadas para evitar la hidrólisis del ARN dependiente de metales.