New England Biolabs, M0616S, FTO ARN desmetilasa

Categorías relacionadas Preparación de bibliotecas de ARN para Illumina,, Especificación de modificación de ARN Definición de unidad Una reacción de 25 μl en tampón de reacción FTO que contiene 100 ng de un ARNm Cluc metilado N6A de 1700 meros y 0,5 ug de ARN desmetilasa FTO incubada durante 1 h a 37 °C da como resultado una desmetilación >50 % del ARNm sustrato según lo determinado por LCMS. Condiciones de reacción 50 mM Tris HCl, pH 7,5 1 mM αKG 1 mM L-ascorbato de sodio 75 mM FE(II) Incubar a 37 °C durante 1 hora. Tampón de almacenamiento: 20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 50 % de glicerol, 0,1 mM TCEP. Inactivación por calor : No. Peso molecular aparente: 59 104,73 g/mol. Condiciones de ensayo: 1 μg de ARN desmetilasa FTO se incuba con 100 ng de un sustrato de ARNm Cluc (1766 meros; 100 % m³A), 50 mM Tris HCl, pH 7,5, 1 mM αKG, 1 mM ascorbato sódico y 75 μM Fe(II) en 25 μL de reacción a 37 °C durante 1 hora. A continuación, la reacción se trata con 0,8 unidades de proteinasa K, grado de biología molecular (P8107) a 37 °C durante 1 hora. El ARN producto se purifica utilizando el kit de limpieza de ARN Monarch® (T2040) y luego se digiere a nucleósidos utilizando la mezcla de digestión de nucleósidos (M0649). El grado de desmetilación de m6A se determina mediante el monitoreo de las diversas especies de adenosina en un UHPLC Agilent 1290 Infinity II equipado con un detector de matriz de diodos G7117A y un detector MS 6135 XT, en una columna Waters XSelect HSS T3 XP (2,1 × 100 mm, 2,5 μm) con la fase móvil de gradiente consistente en metanol y tampón de acetato de amonio 10 mM (pH 4,5). La identidad de cada pico se confirma mediante espectrometría de masas. La abundancia relativa de cada nucleósido se determina por la integración de cada pico a 260 nm o sus respectivos máximos de absorción UV. Preguntas frecuentes : P: ¿Hay productos hm6A y f6A sin reaccionar al final de la reacción de la ARN desmetilasa FTO? R: Sí, se detectan aproximadamente un 20 % de hm6A y un 10 % de f6A al final de la reacción de la FTO ARN desmetilasa con 100 ng de un sustrato de ARNm Cluc (1766 meros; 100 % m6A). P: ¿Cuál es la actividad de la FTO ARN desmetilasa en otros tampones NEB? R: Tris HCl, pH 7,5 suplementado con 1 mM de αKG, 1 mM de L-Asc y 75 μM de Fe(II) es el tampón de reacción óptimo para la FTO ARN desmetilasa (86 % de conversión de m6A). La actividad relativa de la FTO ARN desmetilasa con tampones NEB suplementados con 1 mM de αKG, 1 mM de L-Asc y 75 μM de Fe(II), da como resultado el siguiente % de conversión de m6A. Conversión del tampón % 50 mM Tris HCl, pH 7,5 86 Tampón rCutSmartTM 24 NEBuffer 1,1 73 NEBuffer 2,1 24 NEBuffer 3,1 4 P: ¿Qué son las enzimas para la innovación? R: Enzimas para la innovación (EFI) es un proyecto iniciado por NEB para proporcionar enzimas únicas a la comunidad científica con la esperanza de permitir el descubrimiento de aplicaciones nuevas e innovadoras. Estas enzimas tienen propiedades interesantes y especificidades únicas que no están disponibles comercialmente en ningún otro lugar con la calidad que esperaría de NEB. Los graduados de Enzimas para la innovación son enzimas que han pasado de tener aplicaciones desconocidas o exploratorias a convertirse en la piedra angular de una aplicación definida. Si tiene una idea para una "Enzima para la innovación" con una aplicación sugerida que pueda ser útil, envíenos un correo electrónico a EnzymesForInnovation@neb.com. Para obtener más información, vea el video.