New England Biolabs, M0647S, HiFi Taq ADN Ligasa

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Si la base terminal forma un par de bases Watson-Crick con el molde en esta posición, la ligasa puede unir las dos sondas. Si la base terminal no se aparea, la ligasa no unirá las sondas. Dado que la ligasa es termoestable, la reacción puede ciclarse y los productos de la ligación pueden amplificarse. Para obtener más información sobre la especificidad de la ligasa y las ligasas de alta fidelidad, visite “Especificidad del sustrato y discriminación de desajustes en las ligasas de ADN”. P: ¿Se puede utilizar el tampón HiFi Taq DNA Ligase con otras ligasas de ADN? R: Sí, el tampón HiFi Taq DNA Ligase se puede utilizar con la Taq DNA Ligase. El uso del tampón HiFi Taq DNA Ligase con Taq DNA Ligase dará como resultado un modesto aumento de la fidelidad y la actividad. Las ligasas dependientes de ATP (por ejemplo, 9°N™ DNA Ligase NEB #M0238, T4 DNA Ligase NEB #M0202 y T7 DNA Ligase NEB #M0318) son incompatibles con este tampón. Para obtener más información sobre la especificidad de la ligasa y las ligasas de alta fidelidad, visite “Especificidad del sustrato y discriminación de desajustes en las ligasas de ADN”. P: ¿Se puede utilizar HiFi Taq DNA Ligase en otros tampones? R: Para lograr la mayor fidelidad posible con HiFi Taq DNA Ligase, recomendamos utilizar el tampón HiFi Taq DNA Ligase; sin embargo, HiFi Taq DNA Ligase se puede utilizar en el tampón Taq DNA Ligase con una actividad y fidelidad reducidas. HiFi Taq DNA Ligase se puede utilizar en una variedad de tampones de polimerasa cuando se complementa con 1 mM de NAD con actividad reducida y una fidelidad modestamente reducida. NEB Buffer HiFi Taq DNA Ligase Activity (%) Efecto en la fidelidad HiFi Taq DNA Ligase Buffer 100 - Taq DNA Ligase Buffer 38 ↓↓↓ phi29 Reaction Buffer1 54 ↓↓ Q5® Reaction Buffer1 73 ↓ Standard Taq Reaction Buffer1 90 ↓ ThermoPol Buffer®1 215 ↓↓ 1Suplementado con 1 mM de NAD. 2La suplementación adicional de los tampones de polimerasa con 5 mM de Mg puede aumentar la actividad de HiFi Taq DNA Ligase, pero reducir aún más la fidelidad. P: ¿Cuál es la temperatura de reacción óptima para HiFi Taq DNA Ligase? R: HiFi Taq DNA Ligase es activa en un rango de temperaturas (35-75 °C) con una actividad mucho mayor a temperaturas más altas hasta la Tm de los oligonucleótidos sonda utilizados. Las ligaduras típicas se pueden realizar a 60 °C. Idealmente, la temperatura de reacción debe elegirse en función de la Tm de las sondas utilizadas, con una diferencia de unos pocos grados respecto a la Tm de las sondas utilizadas, calculada en las condiciones del tampón (10 mM MgCl₂, 150 mM KCl) y las concentraciones de sonda utilizadas. La temperatura de reacción óptima para una aplicación determinada debe determinarse empíricamente. P: ¿Cuánta HiFi Taq DNA Ligase se requiere para una reacción? R: Una reacción típica utiliza 1 μL de HiFi Taq DNA Ligase en un volumen de reacción de 50 μL. Consulte la información del producto adjunta para obtener detalles sobre las condiciones de reacción, incluidas las proporciones molares de las sondas, el ADN diana y la enzima. P: ¿Cuántos ciclos de temperatura sobrevivirá la HiFi Taq DNA Ligase? R: La HiFi Taq DNA Ligase mantiene más del 97 % de actividad después de más de 100 ciclos (donde 1 ciclo = 80 °C durante 90 s, 94 °C durante 10 s). P: ¿Se puede utilizar la HiFi Taq DNA Ligase para la clonación? R: No, la HiFi Taq DNA Ligase no liga todos los tipos de extremos. Recomendamos usar la T4 DNA Ligase (NEB #M0202) para la clonación. P: ¿La HiFi Taq DNA Ligase requiere NAD+? R: Sí. Se puede observar actividad traza en tampones sin NAD+ debido a algún cofactor preenlazado a la ligasa. P: ¿Cuál es la estabilidad de la HiFi Taq DNA Ligase a 95 °C? R: La vida media de la HiFi Taq DNA Ligase es superior a 90 min a 95 °C. P: ¿Cuál es la estabilidad de la HiFi Taq DNA Ligase a temperatura ambiente? R: Más de una semana. P: ¿Por qué el tampón HiFi Taq DNA Ligase es marrón? R: El DTT y el NAD reaccionan y se vuelven marrones. El tampón marrón seguirá funcionando. P: ¿Las ADN ligasas termoestables (como la Taq DNA Ligase, la 9°N DNA Ligase y la HiFi Taq DNA Ligase) ligan los extremos cohesivos? R: Si bien estas ligasas termoestables pueden unir extremos cohesivos con una amplia superposición, como los extremos cohesivos de 12 pb del genoma del bacteriófago Lambda, los salientes típicos de 4 pb generados por las enzimas de restricción de tipo II no son buenos sustratos y no se ligarán. No se recomienda el uso de ligasas de ADN termoestables en los flujos de trabajo de clonación tradicionales. P: ¿Tiene la HiFi Taq DNA Ligase actividad en sustratos que contienen ARN? R: La HiFi Taq DNA Ligase solo tiene actividad en sustratos de ADN mellados sin desajustes ni huecos. La HiFi Taq DNA Ligase no tiene actividad medible en sustratos de ARN o ARN/ADN mellados. P: ¿Qué es la LDR y en qué se diferencia de la LCR? R: La LDR (reacción de detección de ligasa) es una metodología dependiente de la ligadura que, a diferencia de la LCR (reacción en cadena de la ligasa), implica solo un par de sondas complementarias a una cadena de ADN diana. El ciclado en la LDR da como resultado una amplificación lineal del producto de la ligadura. Este método se puede utilizar para confirmar la presencia de un SNP particular en una secuencia diana que ha sido amplificada por otro método (como PCR). Al igual que con LCR, el método utiliza una ligasa termoestable de alta fidelidad que puede discriminar contra la ligadura de sondas desapareadas, como Taq ADN Ligasa (NEB #M0208) y 9°N™ ADN Ligasa (NEB #M0238). Para obtener más información sobre la especificidad de la ligasa y las ligasas de alta fidelidad, visite “Especificidad del sustrato y discriminación de desajustes en ADN ligasas”. P: ¿Qué es LCR y qué enzimas recomienda? R: LCR (Reacción en Cadena de la Ligasa) es un método similar a PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) que amplifica el ADN y tiene aplicaciones diagnósticas prometedoras. LCR es un método dependiente de la ligadura que puede distinguir entre secuencias de ADN que difieren en un solo nucleótido (SNP). En la LCR se utilizan cuatro sondas: un par complementario a cada cadena de la secuencia diana, con la unión de ligadura en el SNP que se desea discriminar. El método utiliza ADN ligasas termoestables como la Taq ADN ligasa (NEB #M0208) y la 9°N™ ADN ligasa (NEB #M0238). Para más información sobre la especificidad de las ligasas y las ligasas de alta fidelidad, visite “Especificidad del sustrato y discriminación de desajustes en las ADN ligasas”. P: ¿Cómo puedo diseñar sondas para LDR o LCR para maximizar la especificidad? R: Las sondas para LDR (Reacción de Detección de Ligasa) y LCR (Reacción en Cadena de la Ligasa) deben diseñarse de forma que todas se asocien dentro de un rango de temperatura estrecho (idealmente < 2 °C) y deben tener regiones de asocio de 15 a 30 bases de longitud. Normalmente, la temperatura de reacción óptima para obtener la máxima fidelidad se encuentra aproximadamente entre 2 °C por debajo y 2 °C por encima de la Tm para un conjunto de sondas determinado, calculada según las condiciones del tampón utilizado. Se recomienda encarecidamente el uso de la Calculadora de Temperatura de Reacción de la Ligasa Termoestable para seleccionar la temperatura de incubación. Sin embargo, la temperatura de reacción óptima para un conjunto de sondas debe determinarse empíricamente. Al utilizar la ADN ligasa HiFi Taq, el SNP a discriminar puede aparearse con la base 3' de la sonda anterior (que proporciona el 3'-hidroxilo a la unión de ligación) o con la base 5' de la sonda posterior (que proporciona el 5'-fosfato a la unión de ligación), ya que la ADN ligasa HiFi Taq muestra una mayor discriminación entre pares de bases correctos y no coincidentes a ambos lados de la unión de ligación. Consulte la información del producto para obtener un análisis detallado de la fidelidad de la ligación de no coincidencias con la ADN ligasa HiFi Taq, que ilustra su mayor fidelidad tanto en los extremos 3' como 5' de la unión de ligación, así como las proporciones específicas de discriminación de pares de bases. Para obtener más información sobre la especificidad de la ligasa y las ligasas de alta fidelidad, visite “Especificidad del sustrato y discriminación de desajustes en ligasas de ADN”.