Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, M0648L, APOBEC3A

Categorías relacionadas Enzimas modificadoras de bases, Análisis de metilación del ADN, Enzimas modificadoras de ADN y tecnologías de clonación Especificación Materiales necesarios pero no suministrados Formamida de ssDNA que contenga dC o 5mC (para desnaturalización de dsDNA si es necesario) Tubos de microcentrífuga Termociclador o bloque térmico Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para desaminar 5 pmol de un oligonucleótido de 44 meros marcado con fluorescencia que contiene una única base de citosina en 30 minutos a 37 °C en un volumen de reacción total de 20 μl en tampón de reacción de desaminación 1X. Temperatura de almacenamiento -20 °C Condiciones de reacción Tampón de reacción de desaminación 1X Incubar a 37 °C Inactivación por calor 70 °C durante 10 minutos Condiciones de ensayo de la unidad 5 pmol de oligonucleótido de 44 meros marcado con fluorescencia que contiene una sola citosina se incuban con 1 unidad de APOBEC3A durante 30 minutos a 37 °C en un volumen de reacción total de 20 μl en tampón de reacción de desaminación 1X. El ssDNA que contiene uracilo generado por la enzima se incuba luego con la enzima USER en tampón rCutSmart 1X para escindir la cadena principal de fosfodiéster en el sitio de uracilo. El producto resultante se mide por electroforesis capilar para determinar la actividad de desaminación de APOBEC3A. Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la actividad de APOBEC3A (NEB n.º M0648) en diferentes tampones NE? A: En relación con su actividad óptima en el tampón de reacción de desaminación, APOBEC3A tiene actividad en los siguientes tampones de reacción: NEBuffer r1.1 25% NEBuffer r2.1 <10% NEBuffer r3.1 0% rCutSmart™ Buffer <10% P: ¿Se puede inactivar por calor APOBEC3A (NEB #M0648)? R: Sí, APOBEC3A se puede inactivar a 70 °C durante 10 minutos. APOBEC3A también se puede eliminar mediante tratamiento con proteinasa K termolábil (NEB #P8111). P: ¿Cuál es el peso molecular de APOBEC3A (NEB #M0648)? R: El peso molecular de APOEBEC3A es de 23.856 daltons. P: ¿Es APOBEC3A (NEB #M0648) una proteína marcada? R: APOBEC3A tiene una etiqueta His en el extremo C-terminal. P: ¿Cuál es la actividad relativa de APOBEC3A (NEB #M0648) en diferentes sustratos de ssADN modificados con dC? R: Si bien APOBEC3A tiene como sustrato preferido el ssADN con C, desaminará el ssADN con 5mC con una actividad dos veces menor en una reacción de 30 minutos en las condiciones recomendadas. En una incubación nocturna (16 horas), APOBEC3A puede alcanzar la desaminación completa del ssADN con 5mC y desaminar menos del 10 % del ssADN con 5-hidroximetilcitosina (5hmC). APOBEC3A no es activo en ssADN con beta-glucosil-5-hidroximetilcitosina (5gmC), 5-carboxilcitosina (5caC) o 5-formilcitosina (5fC). Actividad de modificación del ssADN después de 30 min. Actividad después de 16 h C a U 100% 100% 5mC a T 50% 100% 5hmC a 5hmU 0% <10% 5fC a 5fU 0% 0% 5caC a 5caU 0% 0% 5gmC a 5gmU 0% 0% La actividad en sustratos de ssADN C modificados se determinó incubando 1 µl de APOBEC3A con 1 μg (73 pmol) de un oligo de ADN de 44 meros que contenía una sola C o C modificada a 37 °C en un volumen de reacción total de 40 µl en tampón de reacción de desaminación 1X. Las muestras se inactivaron por calor en cada punto temporal y luego se analizaron por LCMS. P: ¿Qué modificaciones del ADN protegen a la citosina de la desaminación por APOBEC3A (NEB n.º M0648)? R: La 5-formilcitosina (5fC), la 5-carboxilcitosina (5caC) y la beta-glucosil-5-hidroximetilcitosina (5gmC) son resistentes a la desaminación por APOBEC3A. P: ¿APOBEC3A (NEB #M0648) es activo en ADN bicatenario? R: No se recomienda APOBEC3A para sustratos de dsADN. Se determinó que la actividad en dsADN era inferior al 10 % incubando 1 µl de APOBEC3A con 5 pmol de dsADN de 44 meros con C durante 30 min a 37 °C en un volumen total de reacción de 20 µl en tampón de reacción de desaminación 1X. Para sustratos de dsADN, recomendamos desnaturalizar el dsADN a ssADN antes de la desaminación añadiendo formamida al dsADN (en agua) e incubando a 85 °C durante 10 minutos, seguido de un enfriamiento inmediato en hielo antes de proceder a la reacción con APOBEC3A. Como alternativa, el dsADN puede desnaturalizarse añadiendo 4 µl de NaOH 0,05 N al dsADN (en agua) e incubando a 85 °C durante 10 minutos, seguido de un enfriamiento inmediato en hielo antes de proceder a la reacción con APOBEC3A. P: ¿APOBEC3A (NEB #M0648) es activo en el ARN? A: Si bien se ha demostrado previamente que APOBEC3A es activo en ARN1,2, no observamos ninguna actividad de APOBEC3A en un sustrato de ARN en nuestras condiciones probadas (1 μg (156 pmol) de ARN de 20 meros que contiene C se incuba con 16 unidades de APOBEC3A durante 2 horas a 37 °C en tampón de reacción de desaminación 1X). Por lo tanto, no recomendamos APOBEC3A para la desaminación de sustratos de ARN. Barka, A. et. al. La enzima editora de bases APOBEC3A cataliza la desaminación de citosina en ARN con baja competencia y alta selectividad. (2022) ACS Chem Biol. 17 (3) 629-636. https://doi.org/10.1021/acschembio.1c00919. Sharma, S. et al. La citidina desaminasa APOBEC3A induce la edición de ARN en monocitos y macrófagos. (2015) Nat Commun. 6, 6881. https://doi.org/10.1038/ncomms7881. P: ¿APOBEC3A (NEB #M0648) exhibe alguna preferencia de secuencia? R: Sí, APOBEC3A tiene preferencia de secuencia por TC > CC > GC > AC 1, 2, 3, donde la C subrayada es la citosina diana para la desaminación en el dinucleótido. Para proporcionar una actividad robusta en todos los sustratos, se utilizó el sustrato menos preferido, un motivo AC, para la definición de la unidad. Silvas, TV. et. al. La selectividad de la secuencia de sustrato de APOBEC3A implica interacciones intra-ADN. (2018) Sci Rep. 8, 7511. https://doi.org/10.1038/s41598-018-25881-z. Stenglein, M. et al. Las proteínas APOBEC3 median la eliminación de ADN extraño de las células humanas. (2010) Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 222-229. https://doi.org/10.1038/nsmb.1744. Vartanian, JP. et al. Evidencia de la edición del ADN del virus del papiloma humano por APOBEC3 en lesiones benignas y precancerosas. (2008) Science. 320, (5873) 230-233. https://doi.org/10.1126/science.1153201. P: ¿A qué temperaturas es activo APOBEC3A (NEB #M0648)? R: APOBEC3A es activo en un rango de temperatura de 25 a 50 °C, pero se recomienda para la actividad de desaminación a 37 °C.