New England Biolabs, M0649S, Mezcla de digestión de nucleósidos

La mezcla de digestión de nucleósidos es una mezcla optimizada de enzimas que proporciona un método conveniente de un solo paso para generar nucleósidos individuales a partir de ADN o ARN para análisis cuantitativo mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS), eliminando la necesidad de protocolos de digestión secuenciales de varios pasos que consumen mucho tiempo. Categorías relacionadas Detección y análisis de hidroximetilación, Análisis del epitranscriptoma, Análisis de metilación del ADN, Especificación Condiciones de reacción Tampón de reacción de mezcla de digestión de nucleósidos 1X Incubar a 37 °C Tampón de reacción de mezcla de digestión de nucleósidos 1X Acetato de sodio 50 mM ZnCl2 1 mM (pH 5,4 a 25 °C) Tampón de almacenamiento Tris-HCl 20 mM MgCl2 1 mM CaCl2 2 mM ZnCl2 2 mM NaCl 50 mM Glicerol al 0,6 % pH 7,5 a 25 °C Preguntas frecuentes P: ¿Para qué aplicaciones se utiliza mejor la mezcla de digestión de nucleósidos? R: La principal aplicación de la mezcla de digestión de nucleósidos es la identificación y cuantificación global de modificaciones de ADN y ARN (p. ej., metilación) mediante análisis LC-MS. P: ¿La mezcla de digestión de nucleósidos digiere el ssADN? R: Sí, la mezcla de digestión de nucleósidos digiere el ssADN en nucleósidos individuales. P: ¿La mezcla de digestión de nucleósidos digiere el ARN? R: Sí, la mezcla de digestión de nucleósidos digiere las moléculas de ARN (excepto las estructuras de capuchón del ARNm) en nucleósidos individuales. La mezcla de digestión de nucleósidos también degrada las cadenas de ADN y ARN de un híbrido de ADN/ARN. P: ¿La mezcla de digestión de nucleósidos digiere el ADN o el ARN en un híbrido de ADN/ARN? R: Sí, la mezcla de digestión de nucleósidos digiere las cadenas de ADN y ARN de un híbrido de ADN/ARN en nucleósidos individuales. P: ¿Cuánto ADN o ARN puede digerir la mezcla de digestión de nucleósidos? R: La mezcla de digestión de nucleósidos (1 µl) puede digerir eficazmente 1 µg de ADN o ARN en nucleósidos en 1 hora a 37 °C. P: ¿Qué tipos de modificaciones epigenéticas se pueden identificar con la mezcla de digestión de nucleósidos? R: La mezcla de digestión de nucleósidos digiere ácidos nucleicos que contienen bases modificadas epigenética y epitranscriptómicamente, como 5-metilcitosina, 5-hidroximetilcitosina, 5-formilcitosina, 5-carboximetilcitosina, N6-metiladenina, 5-hidroximetiluracilo y muchas otras. La mezcla también digiere ciertas bases no naturales o dañadas. P: ¿Existen modificaciones de ácidos nucleicos que la mezcla de digestión de nucleósidos no pueda digerir? R: Sí, la mezcla de digestión de nucleósidos no puede digerir un puente 5'-ppp-5' invertido (como en las estructuras de capuchón del ARNm m7G-G), dímeros de timina ni fosfotioésteres. La mezcla de digestión de nucleósidos presenta una actividad reducida en oligonucleótidos con cadenas principales altamente modificadas con uno o más sustituyentes en las posiciones 2', 4' o 5' de la ribosa, como los ARN antisentido u otros oligonucleótidos terapéuticos diseñados para resistir la escisión por nucleasas. Para asegurar una digestión completa, las muestras que contienen estructuras secundarias complejas y un gran número de modificaciones (en particular, modificaciones en la posición 2' de la ribosa) pueden beneficiarse de la incubación durante la noche con la mezcla de digestión de nucleósidos para lograr una digestión completa. Alternativamente, la proporción de mezcla de digestión de nucleósidos:ácido nucleico puede aumentarse de 1 μl/μg de sustrato a 5-10 μl/μg de sustrato. P: ¿Es la mezcla de digestión de nucleósidos sensible a la sal? R: La mezcla de digestión de nucleósidos es relativamente insensible al contenido de sal; sin embargo, se recomienda que la concentración final de sal en la reacción de digestión se mantenga ≤ 250 mM. P: ¿La mezcla de digestión de nucleósidos digiere el ADN o el ARN almacenados en tampón TE? R: La mezcla de digestión de nucleósidos digiere el ADN o el ARN almacenados en tampones TE habituales (≤1 mM de EDTA). A menos que la concentración final de EDTA en la reacción de digestión sea > 1 mM, no es necesario cambiar el tampón antes de la digestión con la mezcla de digestión de nucleósidos. P: ¿Es necesario purificar el sustrato de ADN/ARN antes de la digestión con la mezcla de digestión de nucleósidos? R: Dado que el arrastre de ciertos componentes de la reacción (p. ej., EDTA, detergentes, etc.) puede provocar una digestión incompleta, se recomienda encarecidamente purificar los sustratos de ADN o ARN (purificación en columna o extracción con fenol/cloroformo seguida de precipitación con etanol/isopropanol) y resuspenderlos en agua antes de la digestión con la mezcla de digestión de nucleósidos. P: ¿Es necesario purificar la mezcla de nucleósidos digerida antes del análisis por LC-MS? R: Normalmente no es necesario purificar la reacción después de la digestión con la mezcla de digestión de nucleósidos y antes del análisis por LC-MS. P: ¿Cuál es la actividad de la mezcla de digestión de nucleósidos en otros tampones? R: Para lograr la máxima actividad posible con la mezcla de digestión de nucleósidos, recomendamos utilizar el tampón de mezcla de digestión de nucleósidos suministrado. Sin embargo, esta mezcla es activa en un amplio rango de pH (de forma óptima entre 4,0 y 7,0) y también tolera la sal (hasta 250 mM). Además, dado que la mezcla de digestión de nucleósidos requiere ZnCl₂, el tampón de reacción debe estar libre de agentes quelantes (p. ej., EDTA) y suplementado con 1 mM de ZnCl₂ para optimizar la actividad en un tampón distinto del tampón de reacción de la mezcla de digestión de nucleósidos suministrado. Aunque la mezcla de digestión de nucleósidos es activa en el tampón NE r1.1 suplementado con 1 mM de ZnCl₂, no lo es en los tampones NEBuffer r2.1, r3.1 ni rCutSmart. NEBuffer r1.1 r2.1 r3.1 rCutSmart® % Actividad 100 0 0 0 P: ¿Requiere ZnCl₂ la mezcla de digestión de nucleósidos? R: Sí, la mezcla de digestión de nucleósidos requiere ZnCl₂ y, por lo tanto, puede inhibirse o inactivarse añadiendo EDTA. P: ¿Se puede incubar la mezcla de digestión de nucleósidos con sustrato durante más de 1 hora? R: Sí, para asegurar una digestión completa, la mezcla de digestión de nucleósidos puede incubarse con la muestra durante períodos más prolongados. No se ha observado deterioro de la señal al incubar muestras de ADN o ARN con la mezcla de digestión de nucleósidos durante periodos prolongados (durante la noche) a 37 °C. Las muestras con un gran número de modificaciones (en particular, modificaciones en la posición 2') pueden beneficiarse de la incubación durante la noche con la mezcla de digestión de nucleósidos para lograr una digestión completa. P: ¿Por qué se congela la mezcla de digestión de nucleósidos al almacenarse a -20 °C? R: Para reducir los efectos de supresión iónica del glicerol durante el análisis por espectrometría de masas, la mezcla de digestión de nucleósidos se ha formulado para contener muy poco glicerol (<1 %) y, por lo tanto, se congela al almacenarse a -20 °C. La mezcla es estable durante más de 2 años cuando se almacena a -20 °C y puede soportar 50 ciclos de congelación-descongelación sin una pérdida significativa de actividad. P: ¿Se puede almacenar la mezcla de digestión de nucleósidos a 4 °C? R: Sí, la mezcla es estable durante al menos 2 años si se almacena a 4 °C sin pérdida significativa de actividad. Sin embargo, recomendamos -20 °C para el almacenamiento prolongado de la mezcla de digestión de nucleósidos, ya que, al igual que con muchos tampones acuosos, el almacenamiento prolongado a 4 °C o temperaturas superiores puede provocar la proliferación de bacterias o hongos.