New England Biolabs, M0650T, EnGen® Spy Cas9 Nickase

Categorías relacionadas Especificación de nucleasas CRISPR/Cas Condiciones de reacción 1X NEBuffer™ r3.1 Incubar a 37 °C 1X NEBuffer™ r3.1 100 mM NaCl 50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 100 µg/ml Albúmina recombinante (pH 7,9 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 300 mM NaCl 10 mM Tris-HCl 0,1 mM EDTA 1 mM DTT 50 % glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 5 minutos Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la diferencia entre EnGen® Spy Cas9 Nickase (NEB n.º M0650) y EnGen Spy Cas9 NLS (NEB n.º M0646)? R: La nickasa EnGen Spy Cas9 contiene una única mutación puntual (D10A) que inactiva el dominio de la nucleasa RuvC, pero deja intacto el dominio de la nucleasa HNH, lo que convierte a la enzima en una nickasa. La NLS de EnGen Spy Cas9 tiene ambos dominios de nucleasa activos y es capaz de escindir ambas cadenas de dsADN. P: ¿Qué señal de localización nuclear está fusionada a la nickasa EnGen® Spy Cas9? R: La nickasa EnGen® Spy Cas9 contiene la señal de localización nuclear (NLS) del antígeno T del virus de los simios 40 (SV40) en los extremos N y C de la proteína. P: ¿Por qué difiere la eficiencia de unión entre dos ARN guía diferentes? R: La eficiencia de unión puede verse influenciada por el diseño del ARN guía. Verifique la secuencia y el diseño de la plantilla de transcripción del ARN guía. También puede verse influenciada por la calidad del ARN guía. Verifique la integridad del ARN guía mediante electroforesis en gel. P: ¿Ofrece NEB sgRNA sintéticos o plásmidos para clonación? R: NEB no ofrece servicios de síntesis de sgRNA ni plásmidos para clonación de sgRNA. Para clonar, recomendamos visitar Addgene para obtener plásmidos de sgRNA. Para transcribir sgRNA rápidamente sin necesidad de clonación ni PCR, recomendamos el kit de síntesis de sgRNA de EnGen para S. pyogenes (E3322S). Como alternativa, se pueden utilizar moldes de oligonucleótidos que codifican un sgRNA bajo un promotor T7 (productos de PCR o plásmidos) para transcribir sgRNA mediante un kit de transcripción in vitro como el kit de síntesis de ARN de alto rendimiento HiScribe T7 Quick de NEB (E2050). P: ¿Cómo se deben orientar los sgRNA offset para una modificación eficiente con la nickasa Cas9 Spy de EnGen®? R: Los informes sobre la modificación genómica mediante la nickasa Cas9 (D10A o H840A) sugieren que la modificación eficiente ocurre cuando los ARNsg se orientan en una orientación de cola a cola (es decir, 5'-5') y cuando están separados por 10 y 30 pb. La escisión en esta orientación resulta en extremos sobresalientes en 5'. La edición fue detectable con pares de ARNsg superpuestos y con pares separados por una mayor distancia (≥40 pb), aunque con una eficiencia reducida (Ran et al. (2013) Cell, 155, 479-480). Recomendamos probar con varios pares de ARNsg para identificar un conjunto que proporcione la eficiencia de edición deseada. P: ¿Por qué observo una digestión incompleta? A: La digestión incompleta puede deberse a los siguientes factores: Relación incorrecta de la nucleasa Cas9 al ARN guía y el sitio diana: para una digestión completa, recomendamos una relación molar de 10:10:1 o superior de la nucleasa Cas9: ARN guía: sitio diana. Secuencia subóptima del ARN guía: verifique la secuencia y el diseño del ARN guía. ARN guía de mala calidad: verifique la integridad del ARN guía mediante electroforesis en gel. Tampón subóptimo: utilice el NEBuffer 3.1 incluido con la enzima. P: ¿Cómo diluyo la enzima a 1 μM para reacciones in vitro? R: Si planea utilizar la enzima de mayor concentración para la digestión in vitro del ADN, la enzima puede diluirse a 1 μM en 1X NEBuffer™ r3.1 y utilizarse inmediatamente. La dilución de 1 μM en 1X NEBuffer r3.1 no debe congelarse. Si la dilución de 1 μM se va a almacenar a -20 °C, debe diluirse con el Diluyente B (con albúmina recombinante) (NEB n.° B8533S): 300 μM de NaCl, 10 μM de Tris-HCl, 0,1 μM de EDTA, 1 μM de DTT, 500 μg/ml de albúmina recombinante y 50 % de glicerol (pH 7,4 a 25 °C) antes del montaje de la reacción. P: ¿Podría explicarme más sobre el cambio de BSA a albúmina recombinante (albúmina recombinante) en los tampones NE? A: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan albúmina recombinante. Creemos que dejar de usar productos con ingredientes de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.