New England Biolabs, M0652S, etiqueta SNAP EnGen® Spy dCas9

Categorías relacionadas Especificación de las nucleasas CRISPR/Cas Condiciones de reacción 1X NEBuffer™ r3.1 Incubar a 37 °C 1X NEBuffer™ r3.1 100 mM NaCl 50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 100 µg/ml Albúmina recombinante (pH 7,9 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 300 mM NaCl 10 mM Tris-HCl 0,1 mM EDTA 1 mM DTT 50 % Glicerol pH 7,4 a 25 °C Preguntas frecuentes P: ¿Dónde se encuentra la señal de localización nuclear en SNAP dCas9 NLS, S. pyogenes? R: SNAP dCas9 NLS, S. pyogenes contiene una señal de localización nuclear ubicada en el extremo C-terminal de la proteína. P: ¿Qué señal de localización nuclear está fusionada a SNAP dCas9 NLS, S. pyogenes? R: SNAP dCas9 NLS, S. pyogenes contiene una señal de localización nuclear (NLS) del antígeno T del virus de los simios 40 (SV40). P: ¿Qué mutaciones inactivadoras se realizaron en SNAP dCas9 NLS, S. pyogenes? R: SNAP dCas9 NLS, S. pyogenes contiene dos mutaciones puntuales, D10A y H840A, que inactivan los dominios de nucleasa de SpCas9. P: ¿Por qué observo una unión incompleta con SNAP dCas9 NLS, S. pyogenes? R: La unión incompleta puede deberse a los siguientes factores: Relación incorrecta de dCas9 con el ARN guía y el sitio diana: para una unión completa, recomendamos una relación molar de 10:10:1 o superior (SNAP dCas9 NLS: ARN guía: sitio diana). Secuencia de ARN guía subóptima: verifique la secuencia y el diseño del ARN guía. ARN guía de mala calidad: verifique la integridad del ARN guía mediante electroforesis en gel. Incompatibilidad del tampón: utilice el tampón NEBuffer 3.1 10X incluido con la enzima. P: ¿Por qué difiere la eficiencia de unión entre dos ARN guía diferentes? R: La eficiencia de unión puede verse afectada por el diseño del ARN guía. Verifique la secuencia y el diseño de la plantilla de transcripción del ARN guía. También puede verse afectada por la calidad del ARN guía. Verifique la integridad del ARN guía mediante electroforesis en gel. P: ¿NEB proporciona plásmidos para la clonación de ARNsg? R: No distribuimos plásmidos para la clonación de ARNsg, pero le recomendamos que visite Addgene si desea obtener plásmidos de ARNsg. Las plantillas de ADN que contienen un promotor T7 y codifican un ARNsg se pueden utilizar con el kit de síntesis de ARN HiScribe T7 Quick High Yield (NEB n.° E2050). Además, existen muchas fuentes comerciales de ARNsg sintético. P: ¿Cómo diluyo la enzima a 1 μM para reacciones in vitro? R: Si se planea usar la enzima de mayor concentración para la digestión in vitro de ADN, se puede diluir a 1 μM en 1X NEBuffer™ r3.1 y usar inmediatamente. La dilución de 1 μM en 1X NEBuffer r3.1 no debe congelarse. Si la dilución de 1 μM se va a almacenar a -20 °C, debe diluirse con el Diluyente B (con albúmina recombinante) (NEB n.° B8533S): 300 μM de NaCl, 10 μM de Tris-HCl, 0,1 μM de EDTA, 1 μM de DTT, 500 μg/ml de albúmina recombinante y 50 % de glicerol (pH 7,4 a 25 °C) antes del montaje de la reacción. P: ¿Podría explicarme más sobre el cambio de BSA a albúmina recombinante (albúmina recombinante) en los tampones NE? A: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan albúmina recombinante. Creemos que dejar de usar productos con ingredientes de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.