Laboratorios de biotecnología de Nueva Inglaterra, M0653S, EnGen® Lba Cas12a (Cpf1)

EnGen Lba Cas12a (Cpf1) es una endonucleasa de ADN programable guiada por un único ARN guía (ARNg). Su diana requiere un ARNg complementario al sitio diana, así como un motivo protoespaciador adyacente (PAM) TTTV en el extremo 5' de la cadena de ADN opuesto a la secuencia diana. La escisión por EnGen Lba Cas12a (Cpf1) se produce aproximadamente a 17 bases 3' del PAM y deja extremos sobresalientes en el extremo 5'. Categorías relacionadas Especificación de nucleasas CRISPR/Cas Condiciones de reacción 1X NEBuffer™ r2.1 Incubar a 37 °C 1X NEBuffer™ r2.1 50 mM NaCl 10 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 100 µg/ml Albúmina recombinante (pH 7,9 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 500 mM NaCl 20 mM acetato de sodio 0,1 mM EDTA 0,5 mM TCEP-HCl 50 % glicerol pH 6 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 10 minutos Preguntas frecuentes P: ¿Cuáles son las diferencias entre EnGen® Lba Cas12a (Cpf1) (NEB n.º M0653) y EnGen Spy Cas9 NLS (NEB n.º M0646)? R: Existen varias diferencias entre EnGen Lba Cas12a (Cpf1) y EnGen Spy Cas9 NLS. Estas diferencias se resumen en la tabla a continuación. EnGen Spy Cas9 NLS EnGen Lba Cas12a (Cpf1) Clasificación Clase II Tipo II Clase II Tipo V Dominios de nucleasa RuvC y HNH Solo RuvC Tamaño 161,3 kDa 150,9 kDa Longitud del ARN guía ~100 nt ~41-44 nt Secuencia PAM NGG TTTN Sitio de escisión 3 bases 5' del PAM ~18 bases 3' del PAM Terminales del producto escindido Extremos romos Saliente 5' P: ¿Qué señal de localización nuclear está fusionada a EnGen® Lba Cas12a (Cpf1)? R: EnGen Lba Cas12a (Cpf1) contiene la señal de localización nuclear (NLS) del antígeno T del virus de los simios 40 (SV40) en los extremos N y C de la proteína. P: ¿Por qué observo una digestión limitada o nula con EnGen® Lba Cas12a (Cpf1)? R: La digestión incompleta puede deberse a los siguientes factores: Relación incorrecta de EnGen Lba Cas12a (Cpf1) con el ARNg o el sitio diana. Para una digestión completa, recomendamos una relación molar de 10:10:1 o superior de EnGen Lba Cas12a (Cpf1): ARNg: sitio diana. Secuencia subóptima del ARNg. Verifique la secuencia y el diseño del ARNg. ARNg de mala calidad. Verifique la integridad del ARNg mediante electroforesis en gel. Uso de un tampón subóptimo. Utilice el diluyente EnGen Lba Cas12a, que se incluye con la enzima. Al diluir 100 µM de EnGen Lba Cas12a (Cpf1) para su uso en ensayos de escisión in vitro, complementar las reacciones con 10 mM de DTT puede, en algunos casos, mejorar la escisión del sustrato. P: ¿Es posible detectar las mutaciones generadas con EnGen Lba Cas12a (Cpf1) utilizando la endonucleasa I T7 (NEB n.° M0302) o el kit de detección de mutaciones EnGen (NEB n.° E3321S)? R: Sí, ambos productos pueden utilizarse para detectar eventos de edición genómica generados con EnGen Lba Cas12a (Cpf1). P: ¿Es posible generar ARNg para su uso con EnGen Lba Cas12a (Cpf1) utilizando el kit de síntesis de ARNsg EnGen para S. pyogenes (NEB n.° E3322)? R: No, el kit de síntesis de sgRNA de EnGen para S. pyogenes no se puede usar para producir gRNA para EnGen Lba Cas12a (Cpf1). El oligonucleótido de andamiaje del ADN de andamiaje de la mezcla de reacción de sgRNA 2X, que contiene la secuencia de tracrRNA, solo es compatible con S. pyogenes Cas9. P: ¿Cómo diseño un ARN guía para usar con EnGen Lba Cas12a? R: El ARN guía (crRNA) para EnGen Lba Cas12a tiene la siguiente secuencia: 5´- UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCCACUCACUGCUUUCUCCUC -3´ La secuencia subrayada es la repetición de crRNA y será la misma para todas las guías de EnGen Lba Cas12a. A la repetición le sigue una secuencia específica del objetivo (no subrayada), que variará según el objetivo. La secuencia diana puede variar entre 18 y 24 nt, pero nunca debe contener el motivo PAM (TTTV). El motivo PAM debe estar en el extremo 5' de la secuencia de ADN no complementaria a la que se dirige. A continuación, se muestra un ejemplo de cómo debería verse la secuencia de ADN del ARNcr mencionado, con el motivo PAM subrayado. P: ¿Cómo diluyo la enzima a 1 μM para reacciones in vitro? R: Si se planea utilizar una mayor concentración de EnGen Lba Cas12a (NEB #M0653T) para la digestión in vitro de ADN, la enzima de 100 μM se puede diluir a concentraciones más bajas en el diluyente EnGen Lba Cas12a (B0653A). La enzima es estable y se puede almacenar a -20 °C en este diluyente. P: ¿Podrían darme más información sobre el cambio de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NE? R: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de cambiar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan albúmina recombinante. Consideramos que dejar de usar productos con ingredientes de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio. P: ¿Qué contiene el diluyente EnGen Lba Cas12a (NEB n.° B0653A)? R: El diluyente EnGen Lba Cas12a (NEB n.° B0653A) tiene la siguiente composición: 500 mM de NaCl, 20 mM de acetato de sodio, 0,5 mM de EDTA, 0,5 mM de TCEP-HCl, 50 % de glicerol, pH 6 a 25 °C. Tiene exactamente la misma composición que el tampón de almacenamiento enzimático. El diluyente EnGen Lba Cas12a (NEB n.° B0653A) debe utilizarse para diluir 100 μM de EnGen Lba Cas12a a concentraciones más bajas para reacciones in vitro, si es necesario.