Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, M0654T, EnGen® Sau Cas9

El tamaño S de este producto se discontinuó el 31 de julio de 2023. M0654T seguirá disponible para su compra. Categorías relacionadas Especificación de las nucleasas CRISPR/Cas Condiciones de reacción 1X NEBuffer™ r3.1 Incubar a 37 °C NEBuffer™ r3.1 100 mM NaCl 50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 100 µg/ml Albúmina recombinante (pH 7,9 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 20 mM Tris-HCl 300 mM NaCl 0,1 mM TCEP 50 % Glicerol pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 5 minutos Preguntas frecuentes P: ¿Cómo se puede determinar la eficiencia de la edición del genoma después de las transfecciones o microinyecciones de EnGen® Sau Cas9 (NEB n.º M0654)? R: La endonucleasa I T7 (NEB n.° M0302) o el kit de detección de mutaciones EnGen (NEB n.° E3321S) pueden utilizarse para determinar los eventos de edición generados por transfecciones o microinyecciones de RNP de Sau Cas9. También pueden utilizarse otros métodos, como la secuenciación de amplicones, para el análisis de la edición. P: ¿Qué señal de localización nuclear se fusiona a EnGen® Sau Cas9? R: EnGen Sau Cas9 contiene señales de localización nuclear (NLS) del antígeno T del virus de los simios 40 (SV40) tanto en el extremo N como en el C-terminal de la proteína. P: ¿Se puede utilizar el kit de síntesis de ARNsg EnGen® (NEB n.° E3322S) para sintetizar ARNsg específicos para Sau Cas9? R: No. El kit de síntesis de ARNsg EnGen es específico para S. pyogenes (Spy). P: ¿Cuál es la secuencia de un ARN guía típico específico para EnGen® Sau Cas9? A: Un ARN guía Sau típico tiene una longitud de ~100 nucleótidos con una secuencia específica del objetivo de 20 a 22 nucleótidos (que se muestra como N en el siguiente ejemplo) y una secuencia específica de Sau que será la misma para todos los ARN guía: 5′NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGUACUCUGGAAACAGAAUCUAAAAACAAGGCAAAAUGCCGUGUUUAUCUCGUCAACUUGUUGGCGAGAUUU3′ La región de 20 a 22 nucleótidos variará en función del ADN objetivo, pero nunca incluirá la secuencia PAM (NNGRRT, N = cualquiera, R = A o G). La secuencia PAM se encuentra en el ADN objetivo, a solo 3' de la cadena de ADN no objetivo en la región objetivo. A continuación se muestra un ejemplo. La cadena inferior del dsDNA en este ejemplo es la cadena objetivo. El PAM (NNGRRT, o en este ejemplo ACGGAT) se encuentra en la hebra no diana, justo 3' respecto a la secuencia diana. P: ¿Cómo puedo sintetizar un sgRNA específico de secuencia para experimentos con EnGen® Sau Cas9? R: Los sgRNA que se utilizarán con EnGen Sau Cas9 pueden sintetizarse in vitro con el kit de síntesis de ARN de alto rendimiento HiScribe® T7 (NEB n.° E2040) o el kit de síntesis de ARN de alto rendimiento HiScribe T7 Quick (NEB n.° E2050). Las plantillas de ADN bicatenario pueden ser productos de PCR, plantillas de ADN bicatenario sintético o plásmidos linealizados. Puede encontrar recomendaciones de diseño más detalladas en la sección de protocolos. Como alternativa, puede solicitar un sgRNA sintético a una empresa de síntesis de ARN. P: ¿Por qué observo una digestión incompleta con EnGen® Sau Cas9 y mi sgRNA Sau específico de la diana in vitro? R: La eficiencia de los sgRNA varía según las secuencias diana específicas. Recomendamos usar una herramienta en línea (que utiliza factores como el contenido de GC) para seleccionar el mejor sitio diana dentro del ADN de interés. También recomendamos purificar el dsADN diana y verificar la integridad del sgRNA en un gel desnaturalizante. Si la eficiencia del sgRNA es baja, aumentar la relación molar sgRNA:Sau Cas9:ADN diana a 10:10:1 o superior puede mejorar la escisión del ADN. También recomendamos usar el NEBuffer™ 3.1 suministrado para obtener mejores resultados. P: ¿Cómo diluyo la enzima a 1 μM para reacciones in vitro? R: Si planea diluir EnGen Sau Cas9 (NEB #M0654T) para la digestión in vitro de ADN, la enzima puede diluirse a 1 μM en rNEBuffer™ r3.1 1X antes del ensamblaje de la reacción y usarse inmediatamente. Si la dilución de 1 μM se va a almacenar a -20 °C, debe diluirse en el tampón de almacenamiento de enzimas: 20 μM de Tris-HCl, 300 μM de NaCl, 0,1 μM de TCEP y 50 % de glicerol (pH 7,5 a 25 °C). P: ¿Pueden darme más información sobre la transición de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NEB? R: En NEB nos complace anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de migrar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan rAlbúmina. Creemos que alejarnos de los productos que contienen ingredientes de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.