New England Biolabs, M0658S, ARN polimerasa Hi-T7®

La ARN polimerasa Hi-T7 está diseñada para Categorías relacionadas Síntesis de ARN Transcripción in vitro (IVT),, Soluciones de nucleótidos para ARN Especificación Materiales requeridos pero no suministrados Inhibidor de ARNasa, murino (NEB #M0314) (opcional) Mezcla de solución de ribonucleótidos (NEB #N0466) Agua libre de nucleasas (NEB #B1500) Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima requerida para incorporar 1 nmol de ATP en material insoluble en ácido en 1 hora a 50 °C. Condiciones de reacción Tampón de reacción de ARN polimerasa Hi-T7 1X, suplementado con 0,5 mM de cada uno de ATP, UTP, GTP, CTP y plantilla de ADN que contiene el promotor de la ARN polimerasa T7. Incubar a 37-56 °C durante 1 hora. La temperatura de incubación óptima es de 50-52 °C. Condiciones de reacción Suplemento de tampón de reacción de ARN polimerasa 1X Hi-T7® con 0,5 mM de ATP, 0,5 mM de UTP, 0,5 mM de GTP y 0,5 mM de CTP Incubar a 50 °C Tampón de reacción de ARN polimerasa 1X Hi-T7® Tris-HCl 40 mM MgCl2 4 mM NaCl 50 mM espermidina 2 mM DTT 1 mM (pH 7,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento Tris-HCl 50 mM NaCl 100 mM EDTA 1 mM DTT 0,1 % (p/v) Triton® X-100 50 % de glicerol pH 7,9 a 25 °C Condiciones de ensayo de la unidad Tampón de reacción de ARN polimerasa 1X Hi-T7, suplementado con 0,5 mM de cada ATP, UTP, GTP, CTP y 1 µg de ADN de fago T7 en un volumen de reacción de 50 μl. Preguntas frecuentes P: ¿Puedo usar un tampón de reacción diferente para la transcripción in vitro con la ARN polimerasa Hi-T7? R: No. El tampón de reacción de la ARN polimerasa Hi-T7 se ha formulado para funcionar específicamente con la ARN polimerasa Hi-T7. P: ¿La ARN polimerasa Hi-T7 reconoce la misma secuencia promotora que la ARN polimerasa T7 de tipo salvaje del bacteriófago? R: Sí. Las ARN polimerasas Hi-T7 y T7 reconocen el mismo promotor: 5′ TAATACGACTCACTATAG 3′ con la transcripción comenzando en la G. La primera base en la transcripción será una G. P: ¿A qué temperatura está activa la ARN polimerasa Hi-T7? R: La ARN polimerasa Hi-T7 está activa entre 37 °C y 56 °C. Al realizar reacciones de transcripción a temperaturas superiores a los 50 °C sugeridos, se recomienda limitar el tiempo de reacción a 30 minutos o menos, ya que la incubación de ARN a alta temperatura durante períodos prolongados en presencia de MgCl₂ (un componente del tampón de reacción de la ARN polimerasa Hi-T7) puede provocar la degradación del ARN. P: ¿Cuáles son las principales causas de fallo en la reacción al utilizar la ARN polimerasa Hi-T7? R: La pureza del molde de ADN es muy importante y debe prepararse mediante métodos de purificación como la columna de centrifugación o la extracción con fenol:cloroformo. Además, para evitar la contaminación por ARNasa, recomendamos usar guantes, puntas con filtro y tubos sin ARNasa. Es importante mezclar bien los componentes de la reacción después de la descongelación y configurar la reacción a temperatura ambiente en el orden indicado en el protocolo para obtener un rendimiento óptimo. P: ¿Qué moldes se pueden utilizar para la transcripción in vitro con la ARN polimerasa Hi-T7? R: El ADN bicatenario que puede usarse como molde con la ARN polimerasa Hi-T7 incluye plásmidos linealizados, productos de PCR u oligonucleótidos complementarios hibridados que contienen la secuencia promotora de T7. P: ¿Puede la ARN polimerasa Hi-T7 transcribir a partir de un plásmido sin cortar? R: Sí. La ARN polimerasa Hi-T7 transcribe alrededor de moldes circulares varias veces sin disociarse. Para transcribir un ARN de una longitud específica, el plásmido puede linealizarse con una enzima de restricción que deja un saliente romo o 5′ aguas abajo del ADN de interés.