New England Biolabs, M0660S, Nucleasa P1

Categorías relacionadas Exonucleasas y endonucleasas no específicas Especificación Unidad Definición Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1,0 µg de nucleótidos solubles en ácido del ARN total de la levadura Torula por minuto a 37 °C en tampón de reacción de nucleasa P1 1X. Condiciones de reacción Tampón de reacción de nucleasa P1 1X Incubar a 37 °C Tampón de reacción de nucleasa P1 1X Acetato de sodio 50 mM (pH 5,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento Tris-HCl 25 mM NaCl 50 mM ZnCl2 1 mM Glicerol al 50 % pH 7,2 a 25 °C Inactivación por calor 75 °C durante 10 minutos Preguntas frecuentes P: ¿La nucleasa P1 es sensible a la sal? R: La nucleasa P1 es relativamente insensible al contenido de sal; sin embargo, se recomienda que la concentración final de sal en la reacción se mantenga ≤ 250 mM. P: ¿Se puede inactivar la nucleasa P1? R: Sí, la nucleasa P1 se puede inactivar añadiendo EDTA (5 mM, concentración final) o mediante inactivación térmica durante 10 minutos a 75 °C. P: ¿Requiere ZnCl₂ la nucleasa P1? R: Sí, la nucleasa P1 requiere ZnCl₂ y, por lo tanto, se puede inhibir/inactivar añadiendo EDTA. Al utilizar la nucleasa P1, hay suficiente ZnCl₂ en el tampón de almacenamiento (1 mM) como para no tener que añadir más ZnCl₂ a la reacción. P: ¿Para qué aplicaciones es más adecuada la nucleasa P1? A: La nucleasa P1 se puede utilizar para la eliminación de colas monocatenarias de moléculas de ADN para crear moléculas con extremos romos, la escisión de bucles de horquilla, el análisis de la composición de bases de ADN o ARN y la eliminación de ácidos nucleicos durante la purificación de proteínas. P: ¿Qué sustratos digiere la nucleasa P1? R: La especificidad del sustrato para la nucleasa P1 es la siguiente: 3′AMP > ARN > ADNmc >> ADNdc. P: ¿Cuánto ADNmc o ARN puede digerir la nucleasa P1? R: La nucleasa P1 (1 unidad) puede liberar eficazmente 1 µg de nucleótidos de ADNmc o ARN por minuto a 37 °C. P: ¿Cuál es la actividad de la nucleasa P1 en otros tampones? R: La nucleasa P1 es activa en un amplio rango de valores de pH (óptimamente entre pH 4,0-7,0). Además, dado que la Nucleasa P1 requiere ZnCl₂, el tampón de reacción debe estar libre de cantidades significativas (< 5 mM) de agentes quelantes (p. ej., EDTA). Al utilizar la Nucleasa P1, el tampón de almacenamiento contiene suficiente ZnCl₂ (5 mM), por lo que no es necesario añadir ZnCl₂ adicional a la reacción. NEBuffer 1.1 2.1 3.1 CutSmart® % Actividad 100 50 25 50 Actividad en otros tampones: Tampón % Actividad Tampón de mezcla de digestión de nucleósidos 100 % Tampón Taq estándar 50 % Tampón Thermopol 25 % Tampón Q5 50 % Tampón DNasa I 75 % Tampón Endo III 75 % Tampón Exo I 25 % Tampón Exo VII 0 % Tampón Lambda Exo 0 % Tampón de nucleasa microcócica 25 % Tampón de nucleasa de frijol mungo 50 % P: ¿Cómo se relaciona la nueva definición de unidad con la definición de unidad histórica para la nucleasa P1? A: La definición de unidad histórica para la actividad 3′-5′-fosfodiesterasa de la nucleasa P1 es la siguiente: Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1,0 μmol de nucleótidos solubles en ácido del ARN total de la levadura Torula por minuto a 37 °C en tampón nucleasa P1 1X. Esta definición de unidad se ha actualizado para que sea directamente comparable con la definición de la unidad 3′-5′-fosfodiesterasa de la nucleasa S1, de modo que la definición de la unidad de actividad 3′-5′-fosfodiesterasa de la nucleasa P1 de NEB es la siguiente: Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1,0 μg de nucleótidos solubles en ácido del ARN total de la levadura Torula por minuto a 37 °C en tampón nucleasa P1 1X. Esta definición de unidad actualizada convierte a la Nucleasa P1 de NEB en un sustituto directo y sencillo de la Nucleasa S1. P: ¿La Nucleasa P1 degrada el ADN bicatenario (ADNbc)? R: Aunque es una nucleasa específica para cadenas simples (ADNmc y ARN), la Nucleasa P1 muestra cierta actividad hacia el ADNmc en el tampón de reacción Nucleasa P1. Si se degradan preferentemente ácidos nucleicos monocatenarios (ADNmc o ARN) en presencia de ADN bicatenario (ADNbc), recomendamos usar la Nucleasa P1 en el tampón NEBuffer 1.1 1X para limitar la actividad sobre el ADNmc y mantener la actividad de la nucleasa monocatenaria.