New England Biolabs, M0665S, Argonauta Tth (TtAgo)

argonaute (TtAgo) es una ADN-endonucleasa programable que requiere una guía corta de ADN monocatenario fosforilada en 5' para dirigir su actividad a una secuencia correspondiente específica en un sustrato. TtAgo introduce una ruptura en la cadena principal de fosfodiéster de la secuencia del sustrato complementario. Categorías relacionadas Argonautes Especificación Diluyente Compatibilidad Diluyente B Tampón de almacenamiento 10 mM Tris-HCl 300 mM NaCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 50% Glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor No Preguntas frecuentes P: ¿Puedo preparar guías funcionales para TtAgo a partir de oligos sintéticos sin modificar? R: Sí. Puede solicitar oligonucleótidos sin modificar y fosforilar las guías utilizando la polinucleótido quinasa NEB T4 y el Protocolo para crear guías fosforiladas en 5' a partir de oligonucleótidos sin modificar para usar con TtAgo. Este método es adecuado para el cribado de alto rendimiento de guías solicitadas en formato de placa de PCR de 96 pocillos. P: Algunas guías no parecen funcionar tan bien con TtAgo como otras. ¿Qué se puede hacer? R: Si bien observamos que algunas secuencias guía se utilizan mejor con TtAgo que otras (consulte las GUIDElines para la optimización de las reacciones de Tth Argonaute (TtAgo) para obtener información detallada y recomendaciones para diseñar guías eficaces), otra posible fuente de problemas puede surgir de la fosforilación 5' incompleta de la guía. Hemos observado que, cuando esta modificación se solicita a proveedores de oligonucleótidos sintéticos, el nivel de fosforilación y la actividad correspondiente pueden variar considerablemente. Para solucionar este problema, sugerimos una de dos opciones: 1) solicitar guías sin modificar y fosforilarlas utilizando la polinucleótido quinasa NEB T4 y el protocolo para la creación de guías fosforiladas en 5' a partir de oligonucleótidos sin modificar para su uso con TtAgo, o 2) si ya se han solicitado guías fosforiladas, simplemente realizar el mismo protocolo de la opción 1 con la polinucleótido quinasa NEB T4 como paso de pulido de la fosforilación. En general, las guías solicitadas con modificaciones de fosforilación tienen un buen rendimiento; sin embargo, cabe destacar que hemos observado que los oligonucleótidos guía fosforilados con la polinucleótido quinasa NEB T4 tienen un rendimiento igual o superior al de los solicitados con una modificación de fosforilación. P: ¿Cómo puedo reducir la actividad endonucleasa no específica con TtAgo? R: Se puede observar actividad inespecífica con sustratos bicatenarios, ya que TtAgo exhibe una actividad degradativa en su forma apo (en ausencia de una guía), conocida como "corte" [Swarts, et al. 2017]. Se cree que esta actividad argonauta participa en la creación de nuevas guías para la defensa celular, pero puede ser problemática in vitro. Hemos observado que algunas secuencias guía, si bien son funcionales para guiar la actividad endonucleasa de TtAgo, pueden no cargarse eficientemente en la argonauta. Por lo tanto, la actividad de "corte" puede tener preferencia sobre la actividad guiada. En estas situaciones, recomendamos precargar la guía con TtAgo antes de intentar una reacción. Mezcle la guía y argonauta en tampón de reacción ThermoPol® 1X NEB e incube a 75 °C durante 10 minutos. Recomendamos usar la guía en un exceso molar de 3 a 5 veces sobre TtAgo para reducir la actividad inespecífica. También hemos observado que reducir la temperatura de reacción y (en menor medida) titular la cantidad de magnesio en la reacción puede afectar la cantidad de actividad no específica observada. P: ¿Puedo almacenar TtAgo con una guía "cargada"? R: No recomendamos almacenar TtAgo con una guía "cargada". Si bien el complejo de nucleoproteína "cargado" debería ser estable durante 1 a 2 días si se almacena correctamente a -20–4 °C, la presencia de la guía de ssDNA es perjudicial para la estabilidad a largo plazo y la actividad de endonucleasa guiada confiable. Mezcle TtAgo y la guía de ssDNA poco antes del uso previsto y en proporción a la escala del experimento que desee realizar. Guarde el complejo en hielo cuando no se use inmediatamente. P: ¿Es TtAgo activo en otros tampones NEB? R: TtAgo muestra el nivel más alto de actividad en el tampón de reacción NEB ThermoPol®; sin embargo, también se observa una actividad significativa en varios otros tampones NEB estándar. Aún se pueden obtener resultados adecuados en tampones no óptimos con tiempos de reacción prolongados. P: ¿Es activa la TtAgo a otras temperaturas? R: La TtAgo es una enzima termófila derivada de Thermus thermophilus. Si bien es activa en un rango de temperaturas (~65 °C-85 °C) (véase la figura a continuación), recomendamos realizar reacciones rutinarias en el rango de temperatura de 75-80 °C. P: ¿Cuánto Mg₂₄ [magnesio(II)] debe incluirse en una reacción típica? R: El tampón de reacción NEB ThermoPol® contiene 2 mM de Mg₂SO₄ (sulfato de magnesio), que es adecuado para la mayoría de las reacciones realizadas con TtAgo. Cantidades mayores de Mg₂₄ pueden mejorar el rendimiento de la TtAgo en algunos sustratos, pero también pueden provocar una actividad más aberrante y fuera del objetivo. Se observa una tendencia similar de rendimiento general ligeramente superior, acompañada de actividad fuera del objetivo, al usar TtAgo con Mn₂₄ que con Mg₂₄. Sin embargo, el Mn₂₄ tiene un rango de concentración de trabajo menor (de 0,1 a 2 mM) en comparación con el Mg₂₄ (de 0,5 a 5 mM). Para más información, consulte las GUIDElines para la optimización de las reacciones de Tth Argonaute (TtAgo). P: ¿Qué ocurre si quiero usar TtAgo con Mn₂₄ [manganeso(II)] en lugar de Mg₂₄ [magnesio(II)], como se proporciona en el tampón de reacción ThermoPol®? R: El TtAgo puede utilizar Mg₂₄ o Mn₂₄ en su sitio activo. Las condiciones de reacción típicas en el tampón de reacción ThermoPol® NEB proporcionado permiten la adición de Mn₂₄ a la reacción en presencia de 2 mM de Mg₂₄, con un efecto similar al del Mn₂₄ solo. Sin embargo, si no se desea Mg₂+ en la reacción, se puede preparar un tampón personalizado. Recomendamos usar un tampón Tris-HCl 20 mM, pH 8,8, con bajo contenido de sal (aproximadamente 10 mM de NaCl o KCl) y añadir Mn₂+ hasta la concentración deseada (normalmente entre 0,1 y 2 mM). Se observa una tendencia similar: un rendimiento general ligeramente superior, acompañado de una actividad fuera del objetivo, al usar TtAgo con Mn₂+ que con Mg₂+; sin embargo, Mn₂+ tiene un rango de concentración de trabajo inferior (de 0,1 a 2 mM) en comparación con Mg₂+ (de 0,5 a 5 mM). Para más información, consulte las GUIDElines para la optimización de las reacciones de Tth Argonaute (TtAgo).