Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, M0667M, EnGen® Spy Cas9 HF1

Categorías relacionadas Especificación de nucleasas CRISPR/Cas Condiciones de reacción 1X NEBuffer™ r3.1 Incubar a 37 °C 1X NEBuffer™ r3.1 100 mM NaCl 50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 100 µg/ml Albúmina recombinante (pH 7,9 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 300 mM NaCl 10 mM Tris-HCl 0,1 mM EDTA 1 mM DTT 50 % glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 5 minutos Preguntas frecuentes P: ¿Dónde se encuentra la señal de localización nuclear en EnGen® Spy Cas9 HF1? R: EnGen Spy Cas9 HF1 contiene dos señales de localización nuclear ubicadas en los extremos N y C de la proteína. P: ¿Qué señal de localización nuclear está fusionada a EnGen® Spy Cas9 HF1? R: EnGen Spy Cas9 HF1 contiene la señal de localización nuclear (NLS) del antígeno T del virus de los simios 40 (SV40) en los extremos N y C de la proteína. P: ¿Cuál es la diferencia entre EnGen® Spy Cas9 HF1 y EnGen Spy Cas9 NLS (NEB n.° M0646)? R: EnGen Spy Cas9 HF1 es una variante de alta fidelidad con cuádruple sustitución (N497A/R661A/Q695A/Q926A) de EnGen Spy Cas9 NLS de Streptococcus pyogenes con una escisión inespecífica reducida del ADN. P: ¿Por qué observo una digestión/edición incompleta con EnGen® Spy Cas9 HF1? R: La digestión incompleta puede deberse a los siguientes factores: Relación incorrecta de la nucleasa Cas9 al ARN guía y el sitio diana: para una digestión completa, recomendamos una relación molar de 10:10:1 o superior de la nucleasa Cas9: ARN guía: sitio diana. Secuencia subóptima del ARN guía: verifique la secuencia y el diseño del ARN guía. ARN guía de mala calidad: verifique la integridad del ARN guía mediante electroforesis en gel. Tampón subóptimo: utilice el NEBuffer™ r3.1 incluido con la enzima. P: ¿NEB proporciona plásmidos para la clonación de ARNg? R: No distribuimos plásmidos para la clonación de ARNsg, pero le recomendamos que visite Addgene si desea obtener plásmidos de ARNsg. Las plantillas de ADN de oligonucleótidos que contienen un promotor T7 y que codifican ARNsg se pueden utilizar con el kit de síntesis de ARN de alto rendimiento rápido HiScribe T7 (NEB n.º E2050). Recomendamos el kit de síntesis de ARNsg EnGen® para S. pyogenes (NEB n.° E3322S), que utiliza oligonucleótidos de ADN específicos para la diana, diseñados por el usuario, y proporciona un método rápido para transcribir altos rendimientos de ARNsg en una sola reacción de 30 minutos. P: ¿Cómo diluyo la enzima a 1 μM para reacciones in vitro? R: Si se planea usar la enzima de mayor concentración para la digestión in vitro de ADN, se puede diluir a 1 μM en NEBuffer™ r3.1 1X y usar inmediatamente. La dilución de 1 μM en NEBuffer r3.1 1X no debe congelarse. Si la dilución de 1 μM se va a almacenar a -20 °C, debe diluirse con el Diluyente B (con albúmina recombinante) (NEB n.° B8533S): 300 μM de NaCl, 10 μM de Tris-HCl, 0,1 μM de EDTA, 1 μM de DTT, 500 μg/ml de albúmina recombinante y 50 % de glicerol (pH 7,4 a 25 °C) antes del montaje de la reacción. P: ¿Podría explicarme más sobre el cambio de BSA a albúmina recombinante (albúmina recombinante) en los tampones NE? A: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan albúmina recombinante. Creemos que dejar de usar productos con ingredientes de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.