Laboratorios Biológicos de Nueva Inglaterra, M0668T, EnGen® Seq1 Cas9

Categorías relacionadas Especificación de nucleasas CRISPR/Cas Condiciones de reacción 1X NEBuffer™ r3.1 Incubar a 37 °C 1X NEBuffer™ r3.1 100 mM NaCl 50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 100 µg/ml Albúmina recombinante (pH 7,9 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 300 mM NaCl 10 mM Tris-HCl 0,1 mM EDTA 1 mM DTT 50 % glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 5 minutos Preguntas frecuentes P: ¿Dónde se encuentra la señal de localización nuclear en EnGen® Seq1 Cas9? R: EnGen Seq1 Cas9 contiene dos señales de localización nuclear ubicadas en los extremos N y C de la proteína. P: ¿Qué señal de localización nuclear está fusionada a EnGen® Seq1 Cas9? R: EnGen Seq1 Cas9 contiene la señal de localización nuclear del antígeno T del virus de los simios 40 (SV40) en los extremos N y C de la proteína. P: ¿Cuál es la diferencia entre EnGen® Seq1 Cas9, EnGen Sau Cas9 (NEB #M0654) y EnGen Spy Cas9 NLS (NEB #M0646)? R: EnGen Seq1 Cas9, EnGen Sau Cas9 y EnGen Spy Cas9 NLS son ortólogos de Cas9 de Streptococcus equinus, Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes, respectivamente. Reconocen los motivos adyacentes al protoespaciador (PAM) de NAGA, NNGRRT y NGG, respectivamente. P: ¿Por qué observo una digestión/edición incompleta con EnGen® Seq1 Cas9? A: La digestión incompleta puede deberse a los siguientes factores: Relación subóptima de nucleasa Cas9 a ARN guía único y sitio diana de ADN: para una digestión completa, recomendamos una relación molar de nucleasa Cas9: ARN guía único: ADN diana de 10:10:1 o superior. Secuencia subóptima del ARN guía único: verifique la secuencia y el diseño del ARN guía único. ARN guía único de mala calidad: verifique la integridad del ARN guía único mediante electroforesis en gel. Tampón de reacción subóptimo: utilice el NEBuffer™ r3.1 incluido con la enzima. P: ¿Por qué difiere la eficiencia de digestión/edición entre dos ARN guía únicos diferentes? R: La eficiencia de digestión puede verse influenciada por el diseño del ARN guía único. Verifique la secuencia y el diseño de la plantilla de transcripción del ARN guía único. También puede verse influenciada por la calidad del ARN guía único. Verifique la integridad del ARN guía único mediante electroforesis en gel. Además, algunos sitios de ADN son más susceptibles a la edición que otros. Pruebe múltiples sitios diana/secuencias de ARN guía únicas adecuadas para la mutación deseada. P: ¿NEB proporciona plásmidos para la clonación de ARNsg? R: No distribuimos plásmidos para la clonación de ARNsg, pero le recomendamos que visite Addgene si desea obtener plásmidos de ARNsg. Las plantillas de ADN que contienen un promotor T7 y codifican un ARNsg pueden usarse con el kit de síntesis de ARN HiScribe T7 Quick High Yield (NEB n.° E2050). Además, existen muchas fuentes comerciales disponibles de ARNsg sintético. P: ¿Podría explicarme más sobre la transición de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NE? R: En NEB nos complace anunciar la transición de los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) a tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan albúmina recombinante. Creemos que dejar de usar productos con ingredientes de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio. P: ¿Se pueden detectar las mutaciones generadas con EnGen Seq1 Cas9 utilizando la endonucleasa I T7 (NEB n.° M0302) o el kit de detección de mutaciones EnGen (NEB n.° E3321S)? R: Sí, ambos productos pueden utilizarse para detectar eventos de edición genómica generados con EnGen Seq1 Cas9. P: ¿Se puede generar ARNsg para usar con EnGen Seq1 Cas9 utilizando el kit de síntesis de ARNsg de EnGen para S. pyogenes (NEB n.° E3322)? R: No, el kit de síntesis de ARNsg de EnGen para S. pyogenes no se puede utilizar para producir ARNsg para EnGen Seq1 Cas9. El oligonucleótido de andamiaje del ADN de andamiaje de la mezcla de reacción 2X para ARNsg, que contiene la secuencia de ARNtracr, solo es compatible con Cas9 de S. pyogenes. P: ¿Cómo se diseña un ARN guía único para usar con EnGen Seq1 Cas9? A: El ARN guía único para usar con EnGen Seq1 Cas9 tiene la siguiente secuencia: 5'- NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUGUGUUGGAAACAACACAGCGAGUUAAAAUAAGGCUUUGUCCGUACACAACUUGUAAAAGUGGCACCCGAUUCGGGUGCAUUUUUU -3' La secuencia espaciadora subrayada de 20 nucleótidos es específica de la región diana de ADN deseada inmediatamente aguas arriba del motivo adyacente al protoespaciador 5'-NAGA-3'. La secuencia espaciadora no contiene la secuencia PAM en sí. La porción del sgRNA no subrayada es el andamiaje específico para la formación del complejo de ribonucleoproteína con EnGen Seq1 Cas9. P: ¿Cómo diluyo la enzima a 1 μM para reacciones in vitro? R: Si se planea usar la enzima de mayor concentración para la digestión in vitro de ADN, se puede diluir a 1 μM en 1X NEBuffer™ r3.1 y usar inmediatamente. La dilución de 1 μM en 1X NEBuffer r3.1 no debe congelarse. Si la dilución de 1 μM se va a almacenar a -20 °C, se debe diluir con el Diluyente B (con albúmina recombinante) (NEB n.° B8533S): 300 μM de NaCl, 10 μM de Tris-HCl, 0,1 μM de EDTA, 1 μM de DTT, 500 μg/ml de albúmina recombinante y 50 % de glicerol (pH 7,4 a 25 °C) antes del ensamblaje de la reacción. P: ¿Por qué observo una digestión/edición incompleta con EnGen® Spy Cas9 HF1? R: La digestión incompleta puede deberse a los siguientes factores: Relación incorrecta de la nucleasa Cas9 al ARN guía y el sitio diana: para una digestión completa, recomendamos una relación molar de 10:10:1 o superior de la nucleasa Cas9: ARN guía: sitio diana. Secuencia subóptima del ARN guía: verifique la secuencia y el diseño del ARN guía. ARN guía de mala calidad: verifique la integridad del ARN guía mediante electroforesis en gel. Tampón subóptimo: utilice el NEBuffer™ r3.1 incluido con la enzima. P: ¿NEB proporciona plásmidos para la clonación de ARNg? R: No distribuimos plásmidos para la clonación de ARNsg, pero le recomendamos que visite Addgene si desea obtener plásmidos de ARNsg. Las plantillas de ADN de oligonucleótidos que contienen un promotor T7 y que codifican ARNsg se pueden utilizar con el kit de síntesis de ARN de alto rendimiento rápido HiScribe T7 (NEB n.º E2050). Recomendamos el kit de síntesis de ARNsg EnGen® para S. pyogenes (NEB n.° E3322S), que utiliza oligonucleótidos de ADN específicos para la diana diseñados por el usuario y proporciona un método rápido para transcribir altos rendimientos de ARNsg en una sola reacción de 30 minutos. P: ¿Cuál es la diferencia entre EnGen® Spy Cas9 HF1 y EnGen Spy Cas9 NLS (NEB n.° M0646)? R: EnGen Spy Cas9 HF1 es una variante de alta fidelidad con cuádruple sustitución (N497A/R661A/Q695A/Q926A) de EnGen Spy Cas9 NLS de Streptococcus pyogenes con una escisión inespecífica reducida del ADN. P: ¿Dónde se encuentra la señal de localización nuclear en EnGen® Spy Cas9 HF1? R: EnGen Spy Cas9 HF1 contiene dos señales de localización nuclear ubicadas en los extremos N y C de la proteína. P: ¿Qué señal de localización nuclear está fusionada a EnGen® Spy Cas9 HF1? R: EnGen Spy Cas9 HF1 contiene la señal de localización nuclear (NLS) del antígeno T del virus de los simios 40 (SV40) en los extremos N y C de la proteína.