Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, M0669M, EnGen® SpRY Cas9

Categorías relacionadas Especificación de nucleasas CRISPR/Cas Condiciones de reacción 1X NEBuffer™ r3.1 Incubar a 37 °C 1X NEBuffer™ r3.1 100 mM NaCl 50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 100 µg/ml Albúmina recombinante (pH 7,9 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 300 mM NaCl 10 mM Tris-HCl 0,1 mM EDTA 1 mM DTT 50 % glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 5 minutos Preguntas frecuentes P: ¿Por qué se llama EnGen SpRY Cas9? R: El nombre SpRY deriva de S. pyogenes y la preferencia por los PAM 5'-NRN-3' sobre los 5'-NYN-3' in vivo (R denota purinas (A o G) e Y denota pirimidinas (C o T)). Sin embargo, SpRY Cas9 prácticamente no muestra preferencia por los PAM in vitro. P: ¿Cuál es la diferencia entre EnGen SpRY Cas9, EnGen Spy Cas9 HF1 (NEB n.° M0667) y EnGen Spy Cas9 NLS (NEB n.° M0646)? R: EnGen Spy Cas9 NLS (NEB #M0646) codifica la secuencia de aminoácidos de Cas9 de tipo silvestre, mientras que EnGen Spy Cas9 HF1 (NEB #M0667) codifica cuatro mutaciones puntuales en la secuencia de aminoácidos de Cas9 (N497A, R661A, Q695A, Q926A) para reducir la escisión inespecífica. EnGen SpRY Cas9 codifica 11 mutaciones puntuales en la secuencia de aminoácidos de Cas9 (A61R, L1111R, D1135L, S1136W, G1218K, E1219Q, N1317R, A1322R, R1333P, R1335Q, T1337R) para un requerimiento de PAM flexible. P: ¿Cómo diseño un ARN guía único para usar con EnGen SpRY Cas9? A: EnGen SpRY Cas9 utiliza el mismo andamiaje de ARN guía único que otros Cas9 de S. pyogenes: 5´-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3´ Las N representan la secuencia de 20 nucleótidos específica del ADN objetivo. Se puede comprar un ARN guía único sintético en una empresa de síntesis de oligonucleótidos. Alternativamente, si se requieren mayores rendimientos, se puede comprar el kit de síntesis de sgRNA NEB EnGen, S. pyogenes (NEB n.º E3322). La siguiente figura ilustra cómo diseñar guías para un sitio de corte de ADN específico: Para cada rotura de doble cadena deseada en el ADN objetivo, hay dos ARN guía simples disponibles (que se dirigen a cualquier cadena del ADN) cuando se utiliza EnGen SpRY Cas9. P: ¿Cómo diluyo la enzima EnGen® SpRY Cas9 a 1 μM para reacciones in vitro? R: Si es necesaria la dilución, diluya la solución de enzima 20 μM proporcionada 1:20 con 1X NEBuffer™ r3.1 antes de configurar las reacciones in vitro. P: ¿Por qué observo una digestión/edición incompleta con EnGen® SpRY Cas9? R: La digestión incompleta puede deberse a los siguientes factores: Relación subóptima de la nucleasa Cas9 con el ARN guía y el sitio diana. Para una digestión completa, recomendamos una relación molar de 10:10:1 o superior de la nucleasa Cas9: ARN guía: ADN diana. Para la linealización de plásmidos, pueden requerirse proporciones más altas de nucleasa/sgRNA. Secuencia subóptima del ARN guía. Verifique la secuencia y el diseño del ARN guía. ARN guía de mala calidad. Verifique la integridad del ARN guía mediante electroforesis en gel. Tampón subóptimo. Utilice el NEBuffer™ r3.1 incluido con la enzima. P: ¿Es necesario limpiar mi reacción antes de usar los productos de digestión con NEBuilder? R: No es necesario limpiar el digesto de SpRY antes de la clonación con NEBuilder, pero puede mejorar los resultados si se realiza. P: ¿Dónde se encuentra la señal de localización nuclear en EnGen SpRY Cas9? R: EnGen SpRY Cas9 contiene una señal de localización nuclear ubicada en el extremo C-terminal de la proteína. P: ¿Qué señal de localización nuclear está fusionada a EnGen SpRY Cas9? R: EnGen SpRY Cas9 contiene la señal de localización nuclear del antígeno T del virus de los simios 40 (SV40) en el extremo C-terminal de la proteína. P: ¿NEB proporciona plásmidos para la clonación de ARN guía? R: No distribuimos plásmidos para la clonación de ARNsg, pero recomendamos usar Addgene si desea obtener plásmidos de ARNsg. Las plantillas de ADN que contienen un promotor T7 y codifican ARNsg se pueden usar con el kit de síntesis de ARN HiScribe T7 Quick High Yield (NEB n.° E2050). Recomendamos usar el kit de síntesis de ARNsg EnGen para S. pyogenes (NEB n.° E3322S), que utiliza oligonucleótidos de ADN específicos para la diana, diseñados por el usuario, y proporciona un método rápido para transcribir ARNsg de alta producción en una sola reacción de 30 minutos. P: ¿Pueden darme más información sobre la transición de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NE? R: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart®) a tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™). También estamos en proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan albúmina recombinante. Creemos que abandonar los productos con ingredientes de origen animal es un paso en la dirección correcta, y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.