New England Biolabs, M0681L, transcriptasa inversa Induro®

Categorías relacionadas Síntesis de ADNc y transcriptasas inversas Aplicaciones RT-PCR,, Síntesis de ADNc,, Transcripción inversa (síntesis de ADNc), Especificación Materiales necesarios pero no suministrados Mezcla de solución de desoxinucleótido (dNTP) (NEB #N0447) Inhibidor de ARNasa, murino (NEB #M0314) Agua libre de nucleasas (NEB #B1500) Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la diferencia entre la transcriptasa inversa Induro (NEB #M0681) y la transcriptasa inversa ProtoScript II (NEB #M0368)? R: Existen principalmente dos tipos de transcriptasas inversas (RT): RT codificadas por retrovirus y RT codificadas por intrones. Ambos tipos de RT comparten algunos dominios conservados y sintetizan ADN complementario a partir de una plantilla de ARN. Las transcriptasas inversas (RT) más comunes y mejor caracterizadas se derivan de retrovirus como el virus de la leucemia murina de Moloney (M-MuLV, MMLV), como la transcriptasa inversa ProtoScript II. Por el contrario, la transcriptasa inversa Induro es una RT codificada por intrones del grupo II que presenta mayor termoestabilidad, mayor procesividad y mejor tolerancia a los componentes de la reacción en comparación con las RT retrovirales. La transcriptasa inversa Induro es útil para la síntesis de ADNc a partir de transcripciones largas, ARN con estructuras secundarias fuertes y muestras de ARN con inhibidores. P: ¿Cómo elijo entre la transcriptasa inversa Induro y los diferentes productos LunaScript y ProtoScript? R: La transcriptasa inversa Induro es una RT codificada por intrones del grupo II que es útil para la síntesis de ADNc a partir de transcripciones largas, ARN con estructuras secundarias fuertes y muestras de ARN con inhibidores. Por el contrario, los reactivos LunaScript son mezclas maestras. El kit LunaScript RT Master Mix (sin cebadores) (NEB n.° E3025) es adecuado para la síntesis general de ADNc. Los productos LunaScript RT SuperMix (NEB n.° E3010/M3010) están optimizados para flujos de trabajo de RT-qPCR de dos pasos donde solo se requieren productos cortos de ADNc. LunaScript RT SuperMix también se incluye en el flujo de trabajo de secuenciación ARTIC SARS-CoV-2. Esta tabla describe las aplicaciones y características de cada uno. Productos de RT retrovirales con codificación intrónica Induro™ Transcriptasa inversa (NEB n.° M0681) Kit LunaScript® RT SuperMix (NEB n.° E3010) LunaScript RT SuperMix (NEB n.° M3010) Kit LunaScript RT Master Mix (NEB n.° E3025) Kit de síntesis de ADNc de primera cadena ProtoScript® II (NEB n.° E6560) Aplicaciones Síntesis de ADNc larga Muestras de ARN impuro Aplicaciones de ARN-seq (p. ej., secuenciación directa de ARN, secuenciación de ADNc de lectura larga, secuenciación de ARNt Aplicaciones Detección por RT-qPCR en 2 pasos Flujo de trabajo de ARN-seq Aplicaciones Flujo de trabajo de ARN-seq Detección por RT-qPCR en 2 pasos Síntesis general de ADNc Detección por RT-PCR en 2 pasos Aplicaciones Síntesis general de ADNc Flujo de trabajo de ARN-seq Detección por RT-PCR en 2 pasos ✓ Protocolo corto ✓ Elección flexible de cebadores, dNTP modificados ✓ Temperatura de reacción más alta ✓ Supermix ✓ Protocolo corto ✓ Colorante de seguimiento ✓ Temperatura de reacción más alta ✓ Selección flexible de cebadores ✓ Protocolo corto ✓ Colorante de seguimiento ✓ Temperatura de reacción más alta ✓ Selección flexible de cebadores ✓ El formato del kit incluye todos los componentes necesarios P: ¿Se puede utilizar la transcriptasa inversa Induro en la secuenciación directa de ARN de Oxford Nanopore Technologies®? R: Sí, Oxford Nanopore Technologies recomienda la transcriptasa inversa Induro para los protocolos de secuenciación directa de ARN (SQK-RNA004). Estos protocolos se pueden descargar de las páginas de la Comunidad ONT (se requiere registro). P: ¿Cuál es la temperatura de reacción óptima para la transcriptasa inversa Induro? R: La temperatura de reacción óptima para la transcriptasa inversa Induro es de 55 °C. Para moldes difíciles, la temperatura de síntesis de ADNc se puede aumentar hasta 60 °C. P: ¿Es posible inactivar ¿Transcriptasa inversa Induro? R: La transcriptasa inversa Induro es termoestable, pero se puede inactivar rápidamente incubándola a 95 °C durante 1 min. Como alternativa, si las aplicaciones posteriores requieren mantener la integridad del ARN (p. ej., secuenciación directa de ARN), se puede utilizar un paso de inactivación a 70 °C durante 10 min. Además, Induro se puede inactivar mediante digestión con proteasas. Por ejemplo, se puede añadir 1 µl de proteasa K termolábil (NEB n.° P8111) a la reacción de ADNc. Tras una incubación a 37 °C durante 15 min, la proteasa K termolábil se puede inactivar incubándola a 55 °C durante 10 min. P: ¿Cuál es el tiempo de incubación recomendado para la transcriptasa inversa Induro? R: El tiempo de incubación recomendado para la transcriptasa inversa Induro es de 10 minutos a 55 °C. Se pueden utilizar tiempos de incubación más largos, de hasta 30 minutos a... Una temperatura de 55 °C puede mejorar el rendimiento de productos de ADNc largos. P: ¿Cuál es el ADNc más largo generado por la transcriptasa inversa Induro? R: El ADNc más largo generado supera los 20 kb según los datos de secuenciación directa de ADNc. P: ¿Cuánta transcriptasa inversa Induro se debe utilizar en una reacción de 20 µl? ¿Se puede mejorar aún más el rendimiento utilizando más enzima? R: En general, 1 µl de transcriptasa inversa Induro (200 unidades) es suficiente en una reacción de 20 µl. El rendimiento de algunos productos de ADNc puede aumentarse duplicando la cantidad de enzima (400 unidades). P: ¿Qué muestras de ARN son compatibles con la transcriptasa inversa Induro? R: Para obtener los mejores resultados, recomendamos la extracción o purificación del material de partida de ARN. Sin embargo, la transcriptasa inversa Induro mantiene su rendimiento robusto en presencia de muchos inhibidores. Recomendamos realizar un experimento piloto para la muestra/ensayo específico. Aumento del MgCl₂ final. (NEB #B9021) concentración de hasta 3 mM a 1X puede mejorar la tolerancia al inhibidor. P: ¿Cuánta plantilla de ARN debo usar? R: Las plantillas de ARN pueden ser ARN total, ARNm o ARN sintetizado por transcripción in vitro. Como regla general, se puede usar hasta 1 μg de plantilla de ARN en una reacción de 20 µl. P: ¿Qué cebador debo usar con Induro Reverse Transcriptase? ¿Puedo añadir cebadores específicos del gen a la reacción de ADNc? R: Para la síntesis de ADNc a partir de ARN con una cola de poli(A), se recomienda el Oligo d(T)23 VN (NEB #S1327). Si se desea, se puede usar un oligo dT más largo. Alternativamente, se puede usar un cebador específico del gen en la reacción de ADNc en lugar del oligo poli(dT). Para plantillas de ARN sin una cola de poli(A), se pueden usar cebadores aleatorios o cebadores específicos del gen para la síntesis de ADNc. La adición de un cebador específico del gen a la reacción de ADNc puede aumentar ligeramente el rendimiento de ADNc de la diana específica. Hemos probado concentraciones finales de cebadores específicos del gen de 0,1 µM, 0,5 µM y 1 µM con un buen rendimiento en todas las concentraciones, pero sugeriríamos 0,5 µM como punto de partida y ajustaríamos según corresponda. P: ¿Cuáles son las mejores aplicaciones para la transcriptasa inversa Induro? R: La transcriptasa inversa Induro exhibe una fuerte termoestabilidad, procesividad y tolerancia a inhibidores. Induro puede superar a otras RT en las siguientes áreas: Síntesis de ADNc desafiante a partir de ARN con estructuras secundarias fuertes, transcripciones largas o muestras impuras. Flujos de trabajo directos de ARN-seq en la plataforma Oxford Nanopore Technologies®. Secuenciación de ADNc de lectura larga. Aplicaciones donde se utilizan RT codificadas por intrones. P: ¿Se pueden utilizar los productos de ADNc generados por la transcriptasa inversa Induro en análisis de PCR en tiempo real? R: LunaScript RT SuperMix (NEB #E3010/M3010) se ha optimizado para flujos de trabajo de RT-qPCR de 2 pasos y se recomienda en lugar de la transcriptasa inversa Induro para esta aplicación en particular. P: ¿Qué ADN polimerasa termoestable se puede utilizar para la PCR después de la síntesis de ADNc? R: Para la PCR posterior, recomendamos la mezcla maestra OneTaq 2X (NEB #M0482 o M0485) para la detección por PCR de hasta 5 kb, la mezcla maestra Q5 Hot Start High-Fidelity 2X (NEB #M0494) para la máxima fidelidad, o la mezcla maestra LongAmp Taq 2X (NEB #M0287) para obtener altos rendimientos a partir de productos más largos. P: ¿Por qué tengo bajos rendimientos de ADNc? R: Existen varias causas para un bajo rendimiento de ADNc. Aquí hay algunas sugerencias para mejorar el rendimiento: Compruebe la integridad del ARN mediante electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante o BioAnalyzer (Agilent). Un ARN intacto de alta pureza es esencial para Síntesis de ADNc de longitud completa. El ARN debe tener una relación A260/A280 mínima de 1,7 o un número RIN superior a 8. La precipitación con etanol seguida de un lavado con etanol al 70 % puede eliminar contaminantes como el EDTA y el guanidinio. La precipitación con cloruro de litio puede eliminar polisacáridos. Un paso de purificación de ARN mediante kits de extracción de ARN o extracción con fenol/cloroformo puede eliminar proteínas contaminantes como las proteasas. Aumente la cantidad de ARN utilizada, especialmente para ARN poco abundante. P: ¿Debo incluir una reacción de control sin RT con Induro® RT para la síntesis de ADNc? R: Sí. La presencia de una cantidad residual de ADN genómico o productos de arrastre puede interferir con la detección posterior. Por lo tanto, es importante realizar las reacciones de control sin RT adecuadas para tener en cuenta estos efectos. El tratamiento de las muestras de ARN con DNasa I (NEB n.° M0303) ayudará a eliminar el ADN contaminante antes de realizar la síntesis de ADNc. P: ¿Cómo sé si mi plantilla... ¿El ARN es de buena calidad? R: El ARN intacto de alta pureza es esencial para la síntesis completa de ADNc. Una relación de absorbancia A260/A280 superior a 1,7 o un número RIN superior a 8 en un BioAnalyzer suele indicar ARN de alta calidad. P: ¿Puedo almacenar la transcriptasa inversa Induro y su tampón de reacción a 4 °C? R: Para un almacenamiento a corto plazo, la enzima puede conservarse a 4 °C durante una semana y el tampón de reacción Induro 5X puede conservarse a 4 °C hasta un mes. Para un almacenamiento a largo plazo, se recomienda almacenar la enzima y el tampón de reacción a -20 °C. P: ¿Puedo preparar mi reacción de síntesis de ADNc a temperatura ambiente cuando utilizo la transcriptasa inversa Induro? R: Sí. Las reacciones de síntesis de ADNc Induro pueden prepararse a temperatura ambiente.