New England Biolabs, M0689S, Authenticase®

Mezcla de nucleasas de estructura específica capaces de reconocer y escindir desajustes externos e indeles. Categorías relacionadas Validación de edición genética basada en CRISPR, enzimas de reparación de ADN y endonucleasas de estructura específica Especificación Condiciones de reacción Tampón de reacción Authenticase 1X Incubar a 42 °C Tampón de reacción Authenticase 1X Tris-HCl 10 mM MgCl2 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 8 a 25 °C) Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM NaCl 500 mM Ditiotreitol 1 mM EDTA 0,1 mM Glicerol al 50 % pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor No Preguntas frecuentes P: ¿Qué condiciones de reacción se utilizaron para definir Authenticase®? R: Una reacción se define como 1 µl de Authenticase en una reacción de 20 µl que contiene tampón de reacción Authenticase 1X, una mezcla de 0,33 pmol de heterodúplex de 60 meros con desapareamientos A/C, T/G y desapareamientos de indel (inserción y/o deleción) de 2 pb, respectivamente. Tras la incubación a 42 °C durante 30 min, se digirió más del 90 % del ADN sustrato, según se determinó mediante gel E de agarosa al 4 %. Puede encontrar más detalles sobre el protocolo y el uso de Authenticase en el manual del producto. P: ¿Cómo mejora Authenticase® la calidad y la fidelidad del ensamblaje de genes por PCR? R: Authenticase es una mezcla patentada de nucleasas con estructura específica capaces de reconocer y escindir regiones externas de desapareamiento e indel (inserción y/o deleción), de entre 1 y 10 pares de bases (pb) en ADN bicatenario. Al eliminar enzimáticamente los errores antes del paso final de renaturalización y amplificación, Authenticase puede reducir los errores en el ensamblaje de genes mediante PCR basada en oligonucleótidos. P: ¿Cómo convierto mi gen de interés en oligonucleótidos? R: Si bien NEB® no ofrece una herramienta web para diseñar oligonucleótidos para la síntesis génica, existen muchas opciones de terceros. Por ejemplo, DNAWorks (https://hpcwebapps.cit.nih.gov/dnaworks/) automatiza el diseño de oligonucleótidos para la síntesis génica mediante métodos basados ​​en PCR. P: ¿Por qué recomiendan configurar dos tubos para la reacción de PCR que contengan diferentes cantidades de muestras tratadas con Authenticase® como plantillas? R: Los flujos de trabajo de síntesis génica DIY suelen enriquecer el gen diana completo antes del ensamblaje del ADN o la clonación en el vector de retención. No es necesario que el usuario configure múltiples reacciones de enriquecimiento; sin embargo, dado que la amplificación por PCR puede producir cantidades variables de la diana completa, sugerimos establecer más de una reacción de PCR para garantizar la generación de una cantidad suficiente de la diana completa. Después de la PCR, seleccione el amplicón con la mayor pureza ejecutando un análisis en gel de agarosa o Bioanalyzer antes de clonar el fragmento. P: ¿Puedo usar Authenticase® para aplicaciones de edición genómica? R: Sí. Authenticase se puede usar para detectar la formación de desajustes/indel (eventos de edición en el objetivo) en flujos de trabajo de edición genómica. Ha sido formulado para escindir desajustes de manera eficiente en ADN heterodúplex y supera el cribado tradicional T7 Endo I en una amplia gama de proporciones mutación/WT. Consulte el ensayo de detección de desajustes (NEB n.º M0689). P: ¿Authenticase® reconoce desajustes de pares de bases individuales o indels (inserciones/deleciones)? R: La respuesta es compleja. Hay ocho tipos de desajustes de bases individuales: C/C, T/C, A/C, T/G, A/G, G/G, T/T y A/A. Authenticase puede reconocer 7 de los 8 desajustes. La excepción es un desajuste A/G. La escisión de estos desajustes con Authenticase es más eficiente que con T7 Endonuclease I, que tiene una actividad limitada en estos desajustes de una sola base (Biochemistry 2004, 43, 4313-4322). Ambas enzimas no tienen problemas para escindir ADN heterodúplex con indeles de 1-10 pb o desajustes de 2-10 pb. P: ¿Qué aditivos comunes inhiben Authenticase®? R: Un agente quelante, como EDTA, inhibirá la reacción. Tenga en cuenta que Authenticase requiere Mg2+, que está en el tampón de reacción. P: ¿Qué reactivos de PCR se recomiendan para la amplificación de ADN en ensayos de detección de desajustes de edición genómica (CRISPR/Cas9, TALEN, ZFN)? R: NEB recomienda Q5® Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix (NEB #M0494). Las ADN polimerasas Q5 ofrecen alta fidelidad y robustez. Para algunas regiones altamente repetitivas, la ADN polimerasa LongAmp® Taq (NEB n.° M0323) ha dado buenos resultados. P: ¿Puedo utilizar los ensayos de detección de desajustes de edición genómica Authenticase® (CRISPR/Cas9, TALEN, ZFN) con productos de PCR sin purificar? R: Sí. Para un análisis rápido, recomendamos usar 6 μl de la reacción de PCR adecuada directamente en una reacción de Authenticase de 20 µl cuando se utilicen los siguientes reactivos de PCR: Q5® Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix (NEB n.° M0494) o OneTaq ADN polimerasa (NEB n.° M0480). Como alternativa, se pueden utilizar de 1 a 12 μl de ADN procesado con el kit de limpieza rápida de PCR Exo-CIP™ (NEB n.° E1050) directamente en una reacción de Authenticase de 20 µl con los siguientes reactivos de PCR: ADN polimerasa de alta fidelidad Q5 (NEB n.° M0491) con tampón de reacción Q5 (hasta 6 µl) o tampón de reacción de ADN polimerasa OneTaq (hasta 12 µl). Para obtener más información, consulte el manual del producto. Para una estimación más precisa de la eficiencia de la edición genómica, se recomiendan los amplicones purificados con el kit Monarch® PCR & DNA Cleanup (NEB n.° T1030). P: ¿Qué tamaño de amplicón de PCR debo diseñar para analizar la eficiencia de la edición genómica? R: Si se va a utilizar un Bioanalizador para analizar la eficiencia de la edición del genoma, NEB recomienda diseñar productos de PCR de alrededor de 700 pb con tamaños previstos de productos escindidos de aproximadamente 450 y 250 pb. P: Si el rendimiento de mi reacción de PCR es bajo, ¿puedo añadir más de 5 µl de la reacción de PCR a la reacción de digestión? R: La digestión se ha optimizado para su uso con hasta 5 µl de reacción de PCR sin purificar. Añadir más de 5 µl de la reacción de PCR podría interferir con la reacción de digestión con Authenticase. Recomendamos optimizar la reacción de PCR para obtener un mayor rendimiento o concentrar la reacción de PCR mediante purificación en columna utilizando el kit NEB Monarch PCR & DNA Cleanup (5 μg) (NEB n.º T1030). P: ¿Por qué veo una banda adicional cuando analizo el heterodúplex sin digerir en un Bioanalizador o en un gel de agarosa? R: En algunos casos, el ADN heterodúplex sin digerir se procesará ligeramente más lento que el ADN homodúplex. Dependiendo de la composición de las mutaciones, esto a veces puede observarse como una banda que se extiende por encima del homodúplex en un gel de agarosa. P: ¿Cuáles son las diferencias entre la Endonucleasa I de Desajustes (NEB #M0678) y la Authenticasa (NEB #M0689)? R: La Endonucleasa I de Desajustes solo escinde los siguientes desajustes de ADN: G/G, G/T y T/T. La Authenticasa escinde todos los desajustes de una sola base (excepto G/A) y todos los desajustes de ADN de 2 o más pares de bases, así como indeles (inserciones y/o deleciones).