New England Biolabs, M0701S, Endonucleasa Q termoestable

Categorías relacionadas Enzimas de reparación de ADN y endonucleasas de estructura específica Especificación Unidad Definición Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para escindir 1 pmol de un oligonucleótido ssDNA de 60 meros que contiene un único sitio de desoxixantosina* en un volumen de reacción total de 20 μl después de 1 hora a 65 °C. *Un sitio de desoxixantosina se prepara sintéticamente con dX en la posición 24 de un oligonucleótido ssDNA de 60 meros marcado con FAM en 5'. Condiciones de reacción 1X NEBuffer™ r2.1 Incubar a 65 °C 1X NEBuffer™ r2.1 50 mM NaCl 10 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 100 µg/ml Albúmina recombinante (pH 7,9 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 10 mM Tris-HCl 500 mM NaCl 0,1 mM EDTA 1 mM DTT 50 % glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor No Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la diferencia entre el conjunto de enzimas USER® (#M5505, #M5508, #M5509) y la endonucleasa termoestable Q (#M0701)? A: Los productos USER (enzima USER (#M5505), enzima termolábil USER II (#M5508) y enzima termoestable USER III (#M5509) son una mezcla de dos enzimas: UDG y una endonucleasa. En contraste, la endonucleasa termoestable Q (#M0701) es una sola enzima. Aunque tanto las enzimas USER como la endonucleasa termoestable Q reconocen y escinden el desoxiuracilo en los sustratos de ADN, los productos resultantes son diferentes. Los productos finales de las enzimas USER son huecos de un nucleótido con extremos funcionales variables según el tipo de USER implementado; se elimina el desoxiuracilo. Los productos de la endonucleasa termoestable Q son mellas con un 3′-OH y un 5′-fosfato; el desoxiuracilo aún está presente en el segmento 3′ del ADN. P: ¿Cuál es la diferencia entre la endonucleasa V (#M0305)? ¿Y la endonucleasa termoestable Q (#M0701)? R: Aunque tanto la endonucleasa V como la endonucleasa termoestable Q reconocen la desoxiinosina en sustratos de ADN que resultan en la formación de una muesca con un 3'-OH y un 5'-fosfato, la ubicación de la muesca es diferente. La endonucleasa V escinde el segundo enlace fosfodiéster en el lado 3' de la desoxiinosina; la endonucleasa termoestable Q escinde el enlace fosfodiéster inmediatamente 5' a la desoxiinosina. Además, la actividad de la endonucleasa V es óptima a 37 °C y puede inactivarse por calor; la actividad de la endonucleasa termoestable Q es óptima entre 65 °C y 85 °C y no puede inactivarse por calor. P: ¿Cuál es la actividad de la endonucleasa termoestable Q (#M0701) en diferentes NEBuffers? R: table, th, td { border: La endonucleasa termoestable Q tiene actividad en los siguientes tampones (en relación con la actividad en NEBuffer r2.1): NEBuffer r1.1 50% NEBuffer r2.1 100% NEBuffer r3.1 100% rCutSmart Buffer 75% ThermoPol® Reaction Buffer 100% ThermoPol II (Mg-free) Reaction Buffer 25% LongAmp® Taq Reaction Buffer Pack 75% Isothermal Amplification Buffer 50% OneTaq Standard Reaction Buffer 75% Standard Taq Reaction Buffer 50% Q5® Reaction Buffer 50% Q5U® Reaction Buffer 75% P: ¿Cuál es el peso molecular de la endonucleasa termoestable Q (#M0701)? R: El peso molecular de la EndoQ termoestable es de 48.515 daltons. P: ¿Es la Endonucleasa Termoestable Q (#M0701) una proteína marcada? R: La Endonucleasa Termoestable Q tiene una etiqueta His en el extremo C-terminal. P: ¿Se puede ligar el producto de la reacción de la Endonucleasa Termoestable Q (#M0701)? R: Sí, se puede ligar el producto de la reacción de la Endonucleasa Termoestable Q. La enzima crea una muesca, lo que resulta en un 3'-OH y un 5'-fosfato. P: ¿A qué distancia del extremo 5' del ADN se escinde la Endonucleasa Termoestable Q (#M0701)? R: La Endonucleasa Termoestable Q puede escindir desoxiuracilo, desoxiinosina y desoxixantosina, incluso desde la tercera posición del extremo 5', tanto en el ADN monocatenario como en el ADN bicatenario. P: ¿A qué distancia del ¿Escinde la endonucleasa termoestable Q (#M0701) el extremo 3' del ADN? R: Como mínimo, la endonucleasa termoestable Q puede escindir desoxiuracilo, desoxiinosina y desoxixantosina a partir de la sexta posición desde el extremo 3' del ADN monocatenario o bicatenario. P: ¿A qué temperaturas es activa la endonucleasa termoestable Q (#M0701)? R: La endonucleasa termoestable Q es activa entre 37 y 90 °C, pero su actividad óptima se alcanza entre 65 y 85 °C. Perfil de temperatura: La endonucleasa termoestable Q es activa en un amplio rango de temperaturas. La actividad de la endonucleasa termoestable Q (#M0701, 0,2 U) se analizó en 1 pmol de un oligonucleótido monocatenario marcado con fluorescencia que contenía un solo uracilo durante 1 hora en tampón NE r2.1 1x a diversas temperaturas. Productos escindidos. Se detectaron mediante electroforesis capilar. La endonucleasa termoestable Q es activa en un amplio rango de temperaturas (37 °C – 90 °C), pero muestra una actividad óptima entre 65 °C y 85 °C. P: ¿Qué bases modificadas reconocerá y escindirá la endonucleasa termoestable Q (#M0701)? R: La endonucleasa termoestable Q reconoce y corta específicamente en desoxiuracilo, desoxiinosina, desoxixantosina y sitios abásicos tanto en ssDNA como en dsDNA. Además, la endonucleasa termoestable Q reconocerá y cortará en ribouracilo dentro de una cadena de ADN. P: ¿Tiene la endonucleasa termoestable Q (#M0701) actividad en dúplex híbridos de ADN-ARN? R: La endonucleasa termoestable Q puede escindir desoxiuracilo dentro de cadenas de ADN cuando la cadena complementaria es ADN o ARN. Además, la endonucleasa termoestable Q reconocerá y cortará en ribouracilo dentro Una cadena de ADN cuando la cadena complementaria es ADN o ARN. La endonucleasa termoestable Q no puede escindir cuando un desoxiuracilo o un ribouracilo se encuentran dentro de una cadena de ARN. P: ¿Cuál es la actividad relativa de la endonucleasa termoestable Q (#M0701) en diferentes sustratos que contienen nucleobases modificadas? R: Actividad relativa de la endonucleasa termoestable Q en varios sustratos de ADN: P: ¿Alguna de las enzimas USER deja extremos ligables al escindir un uracilo? R: No, ni la enzima USER (NEB #M5505), la enzima termolábil USER II (NEB #M5508) ni la enzima termoestable USER III (NEB #M5509) dejarán extremos ligables al escindir un uracilo. Sin embargo, la endonucleasa termoestable Q (NEB #M0701) hará un corte 5' a un uracilo (dejando la nucleobase intacta). Pero dejan los extremos 3' OH y 5' P ligables tras la escisión. P: ¿A qué distancia de los extremos del ADN puede escindir la endonucleasa termoestable Q (NEB #M0701)? R: La endonucleasa termoestable Q escinde un desoxiuracilo de 6 pares de bases o nucleótidos del extremo 5' del ADN, ya sea bicatenario o monocatenario. La endonucleasa termoestable Q escinde un desoxiuracilo de 3 pares de bases o nucleótidos del extremo 3' del ADN, ya sea bicatenario o monocatenario. Para más información, consulte "Escisión del desoxiuracilo cerca de los extremos del ADN bicatenario y el ADN monocatenario".