New England Biolabs, M0766S, Timina-ADN glicosilasa (TDG)

Categorías relacionadas Enzimas de reparación de ADN y endonucleasas específicas de la estructura Especificación Unidad Definición Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para crear un sitio AP a partir de 1 pmol de un dúplex de oligonucleótidos de 60 meros que contiene un único par incorrecto T:G dentro de un contexto CpG* en una reacción total de 20 μl en 1 hora a 37 °C. *El par incorrecto AT:G se prepara ubicando la T en la posición 24 de un ssDNA de 60 meros marcado con FAM en 5' y una G en la posición 25 de un complemento no marcado, recocidos para formar un sustrato dúplex. Condiciones de reacción Tampón de reacción TDG 1X Incubar a 37 °C Tampón de reacción TDG 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM TCEP 0,25 mM Albúmina recombinante 10 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM NaCl 500 mM EDTA 0,1 mM DTT 1 mM Glicerol al 50 % pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 10 minutos Preguntas frecuentes P: ¿La timina-ADN glicosilasa (TDG) (NEB n.º M0766) es una proteína marcada? R: TDG tiene una etiqueta His en el extremo C-terminal. P: ¿Cuál es la actividad de la timina-ADN glicosilasa (TDG) (NEB n.° M0766) en diferentes tampones NE? R: La TDG tiene una actividad del 50 % en el tampón NE r1.1, del 0 % en el tampón NE r2.1, del 0 % en el tampón NE r3.1 y del 20 % en rCutSmart™. Sin embargo, al añadir 1 mM de TCEP o DTT fresco a cada uno de estos tampones en la reacción, la actividad de la TDG se restablece al 100 %. P: ¿La sal inhibe la timina-ADN glicosilasa (TDG) (NEB n.° M0766)? R: El rendimiento de la timina-ADN glicosilasa (TDG) se vuelve subóptimo cuando las concentraciones de sal alcanzan los 200 mM de NaCl. P: No quiero utilizar el tampón de reacción de timina-ADN glicosilasa (TDG) proporcionado para mi experimento. ¿Tienen alguna sugerencia para optimizar las condiciones del tampón? R: La timina-ADN glicosilasa (NEB #M0766) funciona mejor en presencia de un agente reductor, por lo que la adición de 1 mM de DTT o TCEP fresco mejorará considerablemente el rendimiento. En presencia de un agente reductor fresco, la actividad de TDG puede tolerar hasta 200 mM de NaCl antes de verse afectada. P: ¿Se puede inactivar la timina-ADN glicosilasa (TDG) (NEB #M0766) por calor? R: Sí. La TDG se puede inactivar por calor a 65 °C durante 10 minutos. P: ¿Qué bases reconocerá y eliminará la timina-ADN glicosilasa (TDG) (NEB #M0766)? R: Los principales sustratos de TDG son dU o dT desapareados con dG en ADN dúplex, con preferencia por un contexto CpG (1). Además, se ha informado que TDG tiene una amplia tolerancia al sustrato, incluyendo actividad en 5-formilcitosina y 5-carboxilcitosina (productos de oxidación de 5mC)(2), 5-hidroximetiluracilo(3), 3, N4-etenocitosina(4), 5-fluorouracilo(5), y otros derivados modificados(6). Referencias: 1. Waters, TR y Swann, PF (1998). J Biol Chem. 273, 20007-14. 2. He YF et al. Science. (2011). 333, 1303-07. 3. Baker D. et al. (2002) Chem Res Toxicol. 15, 33-9. 4. Saparbaev, M. y Laval, J. (1998). PNAS. 95, 8508-13. 5. Hardeland, U. et al. (2000). J Biol Chem. 275, 33449-33456. 6. Bennett MT et al. (2006). J Am Chem Soc. 128(38), 12510-9. P: ¿Qué sustrato se utiliza para analizar la timina-ADN glicosilasa (TDG) (NEB n.° M0766)? R: Los sustratos utilizados para analizar la actividad enzimática se enumeran en la definición de unidad de cada enzima. La TDG se analiza utilizando un sustrato de dsADN de 60 meros que contiene un par T:G centralmente erróneo en un contexto CpG.