New England Biolabs, M1100L, mezcla maestra de ligasa NEBridge®

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P: ¿Puedo ensamblar amplicones de PCR en lugar de insertos preclonados utilizando los protocolos y productos de Golden Gate Assembly? R: Sí. Para la clonación de un solo inserto, puede usar amplicones sin purificar, pero espere un rendimiento reducido en comparación con los amplicones purificados. Para el ensamblaje de múltiples insertos, los amplicones deben purificarse. Para una purificación robusta de los amplicones de los componentes de la reacción de PCR, recomendamos el kit Monarch® PCR and DNA Cleanup (NEB n.° T1030). P: ¿Cómo funciona la mezcla maestra de ligasa NEBridge en el ensamblaje Golden Gate? ¿Cómo se compara con los protocolos caseros? R: El ensamblaje Golden Gate, que utiliza la mezcla maestra de ligasa NEBridge con siete enzimas de restricción tipo IIS de NEB, se ha optimizado para lograr una alta eficiencia y fidelidad, incluso con ensamblajes complejos de 25 fragmentos. Dependiendo de la complejidad de su reacción de ensamblaje y de la enzima de restricción tipo IIS que elija, puede esperar 106-108 ufc por µg de ADN vector, con una tasa de ensamblaje correcta superior al 80 %. Sabemos que muchos clientes prefieren hacerlo ellos mismos. Sin embargo, esperamos que, al elegir este reactivo, podamos eliminar un obstáculo técnico de su flujo de trabajo y ayudarle a lograr ensamblajes más exitosos. P: Observé altos fondos con el vector vacío al usar la mezcla maestra de ligasa NEBridge. ¿Qué debo hacer? R: Sugerimos realizar la transformación inmediatamente después de que la reacción esté hecha. Si almacena las reacciones a -20 °C durante la noche o por un período prolongado, deberá hacer otra incubación a 60 °C durante 5 minutos justo antes de la transformación. 60 °C favorece la actividad de la enzima de restricción sobre la actividad de la ADN ligasa T4 y puede reducir el fondo al digerir cualquier vector "religado" que aún contenga el sitio de la enzima de restricción. P: Mi NEBridge Ligase Master Mix se ha congelado en mi congelador. ¿Es esto un problema? R: No. NEBridge Ligase Master Mix generalmente permanece líquido durante el almacenamiento a -20 °C. Sin embargo, las temperaturas del congelador varían y si se almacena por debajo de -20 °C puede congelarse. NEB ha realizado pruebas de congelación-descongelación en este producto. Después de 50 ciclos de congelación-descongelación, se conservó más del 80% de su actividad original. P: ¿Se pueden inactivar las reacciones de NEBridge Ligase Master Mix mediante calor? R: Al realizar el ensamblaje Golden Gate con este producto, no es necesario inactivarlo primero. Si bien las enzimas se inactivarán si se calientan demasiado, los componentes del tampón de reacción pueden formar un complejo con el producto de ADN y afectar negativamente el rendimiento de la transformación. P: ¿Puedo usar la reacción NEBridge Ligase Master Mix para transformar células electrocompetentes? R: Sí. La eficiencia de transformación de las células electrocompetentes es generalmente 10 veces mayor que la de las células químicamente competentes. Hemos probado la transformación directa de las reacciones NEBridge utilizando E. coli electrocompetente NEB 10-beta (NEB #C3020). Siguiendo el protocolo de electroporación proporcionado con NEB 10-beta y utilizando 1 µL de la reacción Golden Gate Assembly con 25 µL de células electrocompetentes NEB 10-beta, no experimentamos ningún problema, como la formación de arcos eléctricos. P: ¿Qué enzimas de restricción se utilizan en Golden Gate Assembly? R: Golden Gate Assembly es un método de clonación eficiente en un solo tubo basado en enzimas de restricción de tipo IIS que escinden fuera de sus sitios de reconocimiento y dejan salientes de 3 o 4 bases. BsaI es la enzima de tipo IIS más utilizada para el ensamblaje Golden Gate. NEB también ofrece una versión de alta fidelidad de esta enzima, BsaI-HF®v2, que cuenta con la ventaja adicional de estar certificada como Time-Saver™ (puede digerir ADN en 5-15 minutos o durante la noche sin degradarlo a ADN) y presenta una actividad estrella drásticamente reducida. Otras enzimas de tipo IIS utilizadas en el ensamblaje Golden Gate incluyen BsmBI-v2/Esp3I, BbsI/BbsI-HF, PaqCI (isoesquizómero AarI con secuencia de reconocimiento de 7 pb) y SapI/BspQI/BspQI-HF (con secuencia de reconocimiento de 7 pb y salientes de 3 pb). P: ¿Qué afecta la eficiencia del ensamblaje Golden Gate? R: La clonación de un solo inserto es significativamente más eficiente que la clonación de múltiples insertos. La eficiencia del ensamblaje disminuye a medida que aumenta el número de fragmentos. La presencia de secuencias repetitivas en un inserto también reduce la eficiencia. Para insertos < 250 pb o > 3 kb, la preclonación aumentará la eficiencia. Por último, las restricciones normales en el tamaño total del plásmido que permiten el mantenimiento estable en E. coli se aplican a los ensamblajes Golden Gate. Las eficiencias son más altas con construcciones de plásmidos de producto ensamblado ~ 10-12 kb. Se pueden realizar ensamblajes completos de mayor tamaño, pero requerirán un mayor número de colonias para ser examinadas para los productos ensamblados correctos de longitud completa. Para ejemplos experimentales de complejidad vs. eficiencia, consulte la Nota Técnica del Ensamblaje Golden Gate. P: ¿Cuántos pares de bases deben tener mis insertos de amplicón flanqueando el sitio de restricción Tipo IIS? R: Los insertos de amplicón deben poseer bases flanqueantes 5' y sitios de restricción Tipo IIS en ambos extremos del amplicón en la orientación correcta. Recomendamos agregar 6 bases flanqueantes en los extremos 5' de los cebadores para una unión óptima de la enzima de restricción Tipo IIS, la escisión y la eficiencia general del Ensamblaje Golden Gate. Esta recomendación de 6 pares de bases reemplaza otras preferencias conocidas de longitud de extremo para las enzimas de restricción Tipo IIS debido a que los protocolos de ensamblaje Golden Gate requieren una actividad enzimática máxima para un ensamblaje eficiente.