New England Biolabs, M1202S, helicasa Tte UvrD

Categorías relacionadas PCR, qPCR y tecnologías de amplificación Aplicaciones Amplificación dependiente de helicasa,, Amplificación isotérmica mediada por bucle,, Amplificación de ADN, PCR y qPCR Especificación Condiciones de reacción Paquete de tampón de amplificación isotérmica 1X Suplemento con 1 mM de ATP Incubar a 65 °C Paquete de tampón de amplificación isotérmica 1X Tris-HCl 20 mM (NH4)2SO4 10 mM KCl 50 mM MgSO4 2 mM Tween® 20 al 0,1 % (pH 8,8 a 25 °C) Concentración de uso 0,2 - 0,4 ng/μl Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM KCl 100 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM Triton® X-100 al 0,1 % Glicerol al 50 % pH 7,4 a 25 °C Calentar Inactivación a 80 °C durante 5 minutos Preguntas frecuentes P: ¿La helicasa Tte UvrD (NEB n.º M1202) requiere alguna estructura de ADN específica para desenrollarse? R: No, la helicasa Tte UvrD puede utilizar cualquier estructura de ADN bicatenario como sustrato para desenrollarse. Esto incluye ADN dúplex y dúplex con salientes de ADNmc en 3′ y 5′ (1-3). Referencias An, L., Tang, W., Ranalli, TA, Kim, HJ, Wytiaz, J. y Kong, H. (2005). J Biol Chem 280(32):28952-8. Mauris, J. y Evans, TC Jr. (2010). J Biol Chem 285(15):11087-92. Vincent, M., Xu, Y. y Kong, H. (2004). EMBO Rep 5(8):795-800. P: ¿Cómo se utiliza la helicasa Tte UvrD para reducir la amplificación de la proteína no molde en reacciones LAMP? R: Sugerimos añadir 10 ng de helicasa Tte UvrD a una reacción LAMP de 25 μl con el kit WarmStart® LAMP (NEB n.° E1700). Se recomienda añadir helicasa a todas las reacciones, ya que su efecto en el rendimiento de las reacciones que contienen el ADN o ARN diana es mínimo (aunque la señal de fluorescencia puede disminuir; el tiempo de reacción no debería verse afectado). Para reacciones con niveles muy altos de amplificación de la proteína no molde, puede ser necesario aumentar la cantidad de helicasa. Si la señal positiva se ve afectada, se debe reducir la cantidad de helicasa. Los rangos sugeridos para usar en reacciones LAMP con las ADN polimerasas indicadas son los siguientes: ADN polimerasa Bst, fragmento grande (NEB n.º M0275): 5-10 ng por reacción (0,2-0,4 ng/μl) ADN polimerasa Bst 2.0® (NEB n.º M0537): 10-15 ng (0,4-0,6 ng/μl) ADN polimerasa Bst 3.0 (NEB n.º M0374): 10-20 ng (0,4-0,8 ng/μl) P: ¿Es compatible la helicasa Tte UvrD con la mezcla maestra WarmStart Colorimetric LAMP 2X (NEB n.º M1800)? R: No, la helicasa Tte UvrD no debe usarse con LAMP colorimétrico. A medida que la UvrD actúa sobre los sustratos de ADN, hidroliza dATP, liberando un H+ con cada hidrólisis, de forma similar a como lo hace una ADN polimerasa al incorporar dNTP. Esta producción de protones provocará una disminución del pH de la solución colorimétrica LAMP, independientemente de cualquier reacción de amplificación, lo que cambiará el color de todas las reacciones que contengan la mezcla maestra colorimétrica WarmStart LAMP 2X y los cebadores de oligonucleótidos. P: ¿Es necesario añadir ATP para la actividad de la helicasa Tte UvrD? R: Si se utiliza la helicasa Tte UvrD para la actividad de la helicasa, independientemente de cualquier actividad de la ADN polimerasa o de amplificación, o en un tampón de amplificación isotérmica, sí, se debe añadir 1 mM de ATP a la mezcla de reacción. Si se añade la helicasa Tte UvrD a una reacción de amplificación (por ejemplo, a la mezcla maestra WarmStart LAMP), el dATP presente en la mezcla se utilizará para el desenrollado. P: ¿Es activa la helicasa Tte UvrD en otros tampones? R: La actividad óptima se logra con el tampón de amplificación isotérmica recomendado, suplementado con 1 mM de ATP, o en la mezcla maestra WarmStart LAMP 2X (NEB n.° E1700). Sin embargo, la helicasa Tte UvrD es activa en otros tampones, y la actividad relativa en otros tampones potenciales se muestra a continuación: Tampón Actividad relativa Tampón NE 1.1 100 % Tampón NE 2.1 100 % Tampón NE 3.1 75 % Tampón CutSmart® 100 % Tampón de amplificación isotérmica II 10 % Tampón ThermoPol® 100 % Mezcla maestra WarmStart LAMP 100 % P: ¿Puedo comprar grandes cantidades de una enzima existente para innovación? R: Sí, si necesita grandes cantidades de una enzima para innovación, póngase en contacto con NEB en EnzymesForInnovation@neb.com. Tenga en cuenta que la disponibilidad puede ser limitada y, por lo tanto, se requieren plazos de entrega más largos para pedidos grandes. Es posible que se requieran pruebas de control de calidad adicionales para satisfacer sus necesidades y aplicaciones específicas. P: ¿Qué son las enzimas para la innovación? R: Enzimas para la innovación (EFI) es un proyecto iniciado por NEB para proporcionar enzimas únicas a la comunidad científica con la esperanza de facilitar el descubrimiento de aplicaciones nuevas e innovadoras. Estas enzimas poseen propiedades interesantes y especificidades únicas que no están disponibles comercialmente en otros lugares con la calidad que se espera de NEB. Los graduados de Enzimas para la innovación son enzimas que han pasado de tener aplicaciones desconocidas o exploratorias a convertirse en la piedra angular de una aplicación definida. Si tiene una idea para una "Enzima para la innovación" con una aplicación sugerida que pueda ser útil, envíenos un correo electrónico a EnzymesForInnovation@neb.com. Para obtener más información, vea el video.