New England Biolabs, M1282S, WarmStart® Afu Uracilo-ADN Glicosilasa (UDG)

Categorías relacionadas Enzimas de reparación de ADN y endonucleasas específicas de la estructura Definición de la unidad de especificación Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para liberar 60 pmol por minuto de un oligonucleótido de ADN monocatenario de 47 meros marcado con fluorescencia que contiene una única base de uracilo en 30 minutos a 65 °C en un volumen de reacción total de 50 μl en tampón Thermopol II 1X. Condiciones de reacción 1X ThermoPol® II (libre de Mg) Tampón de reacción Incubar a 65 °C 1X ThermoPol® II (libre de Mg) 20 mM Tris-HCl 10 mM (NH4)2SO4 10 mM KCl 0,1 % Triton® X-100 (pH 8,8 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 10 mM Tris-HCl 50 mM KCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 0,1 mg/ml Albúmina recombinante 50 % Glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor No Peso molecular Teórico: 22717 daltons Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la actividad de WarmStart Afu Uracil-ADN glicosilasa (UDG) en NEBuffers? R: La uracilo-ADN glicosilasa (UDG) y la uracilo-ADN glicosilasa (UDG) de WarmStart Afu presentan muy poca actividad en los NEBuffers r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart. P: ¿Funcionará la uracilo-ADN glicosilasa (UDG) de WarmStart Afu en el tampón Thermopol®? R: La uracilo-ADN glicosilasa (UDG) de WarmStart Afu es activa en el tampón Thermopol. P: ¿Cuál es el peso molecular de la uracilo-ADN glicosilasa (UDG) de WarmStart Afu? R: El peso molecular de la uracilo-ADN glicosilasa (UDG) de WarmStart Afu es de 22,7 kDa. P: ¿Es la uracilo-ADN glicosilasa (UDG) de WarmStart Afu una proteína marcada? R: No. La uracilo-ADN glicosilasa (UDG) de WarmStart Afu no es una proteína marcada. P: ¿El inhibidor de la uracilo-ADN glicosilasa (UGI) inhibe la uracilo-ADN glicosilasa (UDG) de WarmStart Afu? R: No. En condiciones estándar, UGI no inhibe la uracilo-ADN glicosilasa (UDG) de WarmStart Afu. P: ¿Libera la uracilo-ADN glicosilasa (UDG) de WarmStart Afu el uracilo del ssADN y del dsADN? R: La uracilo-ADN glicosilasa (UDG) de WarmStart Afu actúa igualmente bien en el ssADN y en el dsADN, por lo que las recomendaciones de uso son las mismas para ambos tipos de sustratos. P: ¿Corta la uracilo-ADN glicosilasa (UDG) de WarmStart Afu el ARN? R: No, la uracilo-ADN glicosilasa (UDG) de WarmStart Afu no debería actuar sobre un sustrato de ARN. Las enzimas UDG evolucionaron para reparar los residuos dU en el ADN, que pueden crearse mediante la desaminación de dC (evitando así la mutación de un par de bases C:G a T:A que ocurriría al replicarse la cadena U). P: ¿Funcionará la uracil-ADN glicosilasa (UDG) WarmStart Afu en el tampón Fpg? R: No. La uracil-ADN glicosilasa (UDG) WarmStart Afu no funciona en el tampón Fpg. P: ¿Qué significa WarmStart? R: WarmStart® es el término que utilizamos para describir una enzima mesófila inactiva a temperatura ambiente, que se activa cuando la reacción se calienta por encima de aproximadamente 40 °C. La tecnología WarmStart se encuentra en los siguientes productos: ADN polimerasa WarmStart Bst 2.0 (NEB #M0538), transcriptasa inversa WarmStart RTx (NEB #M0380), productos Luna de RT-qPCR de un solo paso (www.lunaqpcr.com), WarmStart Nt.BstNBI (NEB #R0725) y uracilo-ADN glicosilasa (UDG) WarmStart Afu (NEB #M1282S). Para más información sobre el uso de aptámeros para controlar la actividad enzimática, consulte este artículo. P: ¿Cómo se puede utilizar la uracilo-ADN glicosilasa (UDG) WarmStart Afu para prevenir la contaminación cruzada? R: La uracilo-ADN glicosilasa (UDG) WarmStart Afu es inactiva a temperaturas más bajas y no interfiere con la amplificación de SDA por debajo de 42 °C. Por el contrario, la uracilo-ADN glicosilasa (UDG) Afu es activa a <42 °C e inhibe completamente la amplificación de SDA a estas temperaturas. Además, la uracilo-ADN glicosilasa (UDG) WarmStart es completamente activa a 65 °C y puede escindir los uracilos incorporados del producto SDA una vez que la temperatura se eleva a 65 °C. La prevención de la contaminación por arrastre mediante la uracilo-ADN glicosilasa (UDG) WarmStart requiere dos pasos: la incorporación de dUTP a temperaturas más bajas (<42 °C) por una ADN polimerasa durante la generación del amplicón, y la escisión posterior a la amplificación de dichos uracilos en los productos amplificados y la destrucción del amplicón catalizada por la uracilo-ADN glicosilasa (UDG) WarmStart a temperaturas más altas (~65 °C). P: ¿Qué es la amplificación por desplazamiento de cadena (SDA)? R: La amplificación por desplazamiento de cadena es un método isotérmico de amplificación de ADN in vitro que utiliza una enzima de corte para cortar una cadena de ADN bicatenario y una ADN polimerasa con deficiencia de exonucleasa para extender el extremo 3' en el corte y desplazar la cadena de ADN aguas abajo (GT Walker, 1992). Este método permite detectar rápidamente un ácido nucleico diana con alta sensibilidad en el punto de atención y se ha convertido en un método popular de diagnóstico molecular. Mostramos una reacción típica de SDA con WarmStart Nt.BstNBI (NEB #R0725) y la ADN polimerasa Bst 2.0 WarmStart® (NEB #M0538) para detectar la diana hBRCA1 en ADN genómico HeLa en WarmStart Nt.BstNBI. Para obtener más información y ver nuestra oferta de productos de amplificación por desplazamiento de cadena y amplificación con enzimas de corte, visite aquí.