New England Biolabs, M1284S, ARNasa 4

La ARNasa 4 es una endorribonucleasa monocatenaria que escinde el ARN en los sitios de dinucleótidos uridina-purina (U/R). Categorías relacionadas: ARNasas. Especificación: Unidad. Definición: Una unidad de ARNasa 4 se define como la cantidad de enzima necesaria para escindir 1,8 pmol de un sustrato de ARN de 45 meros que contiene un único sitio de corte U/A en 60 minutos a 25 °C. Condiciones de reacción 1X NEBuffer™ r1.1 Incubar a 37 °C 1X NEBuffer™ r1.1 10 mM Bis-Tris-Propano-HCl 10 mM MgCl2 100 µg/ml Albúmina recombinante (pH 7 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 100 mM NaCl 50 mM NaOAc 200 µg/ml Albúmina recombinante 50 % Glicerol pH 6 a 25 °C Inactivación por calor No Preguntas frecuentes P: ¿La ARNasa 4 (NEB n.º M1284) corta el ARN en sitios distintos a U/A y U/G? R: La preferencia observada de la ARNasa 4 es U/A > U/G >>> C/A. Se observa una baja actividad de C/A cuando hay altas concentraciones de ARNasa 4 en relación con el ARN diana. P: ¿Cuánta ARNasa 4 (NEB n.° M1284) debo usar para digerir el ARN para el mapeo de secuencias de nucleótidos mediante LC-MS/MS? R: La adición de 1 µl de ARNasa 4 (NEB n.° M1284) (50 000 U/ml) proporciona la máxima cobertura de secuencia para 10 µg de ARN IVT sin modificar de 1 a 5 kb de longitud en una reacción de 30 µl (1X NEBuffer r1.1, 1 M de urea) incubada a 37 °C durante 1 h. Sin embargo, al igual que con el uso de ARNasa T1 o ARNasa A pancreática bovina, la cantidad ideal de unidades de ARNasa 4 necesarias puede ser mayor o menor según el ARN diana. La ARNasa 4 se puede diluir en 1X NEBuffer r1.1, que se incluye como solución 10X. P: ¿Cuál es la identidad química de los oligonucleótidos 5' y 3' generados tras la escisión con la ARNasa 4 (NEB #M1284)? R: Tras la escisión con la ARNasa 4, los oligonucleótidos 5' aguas arriba terminarán con uridina y contendrán una población mixta de extremos 3', principalmente 3'-fosfato o 2', 3'-fosfato cíclico. Los oligonucleótidos 3' aguas abajo comenzarán con una purina (A o G) y contendrán extremos 5'-hidroxilados. P: ¿Cuánta ARNasa 4 (NEB #M1284) debo usar para el análisis de ARNm con capuchón 5' dirigido por sonda de ADN? R: La recomendación actual es diluir la ARNasa 4 (50.000 U/ml) 1:30 en tampón NE r1.1 1X. Añadir 1 µl de ARNasa 4 diluida será suficiente en reacciones que contengan 5 µg de ARN diana hibridado con 40 pmol de sonda de ADN (2023 Wolf et al. ACS Pharmacol. Transl. Sci.). P: ¿Se puede inactivar la ARNasa 4 (NEB n.º M1284)? R: La adición de 40 U de inhibidor de ARNasa murina (NEB n.º M0314) o inhibidor de ARNasa de placenta humana (NEB n.º M0307) a temperatura ambiente inhibe eficazmente la ARNasa 4 tras las condiciones de digestión estándar. Para aplicaciones posteriores que no sean sensibles a detergentes ni agentes quelantes, una solución de SDS al 0,2 % (p/v) y EDTA 20 mM, pH 8,0, inactiva completamente la ARNasa 4. P: ¿Es la actividad endonucleolítica de la ARNasa 4 (NEB n.º M1284) sensible a las modificaciones del ARN? R: Se han probado numerosas modificaciones de uridina con una disminución nula o mínima de la actividad de la ARNasa 4, incluyendo las especies pseudo-, N1-metil-pseudo-, 5-metoxi y dihidrouridina (Ψ, m1Ψ, mo5U y D). Para digerir eficazmente el ARN que contiene estas modificaciones, especialmente m1Ψ, recomendamos aumentar el volumen añadido de 1 µl a 3 µl de ARNasa 4 (50.000 U/ml) en digeridos equivalentes de 10 µg de ARN. Dado que la actividad endonucleolítica de la ARNasa 4 requiere el 2'-hidroxilo del nucleótido de uridina, modificaciones como la 2'-O-metiluridina (Um) inhiben completamente la actividad de la ARNasa 4. P: ¿Afecta la estructura secundaria del ARN a la actividad de la ARNasa 4 (NEB n.° M1288)? R: Para una cobertura óptima del mapeo de secuencias de nucleótidos, se recomienda realizar digestores con ARNasa 4 en condiciones desnaturalizantes para limitar la posible influencia de la estructura secundaria del ARN. Una reacción de digestión con una concentración final de urea de 1 M, incubada a 37 °C durante 1 h, garantizará que la mayor parte del ARN esté disponible para la escisión endonucleolítica. La actividad endorribonucleasa de la ARNasa 4 tolera hasta 3 M de urea o 50 % de formamida (v/v). La actividad de reparación terminal de la polinucleótido quinasa T4 tolera hasta 3 M de urea o 25 % de formamida (v/v). P: ¿Podrían explicarme más sobre el cambio de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NE? R: En NEB nos complace anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan albúmina recombinante. Consideramos que dejar de usar productos de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio. P: ¿Es necesario el magnesio para la actividad de la ARNasa 4? R: La ARNasa 4 no requiere magnesio para la actividad endorribonucleasa.