New England Biolabs, M1288L, mezcla para digestión con ARNasa 4 y reparación del extremo 3'

Preguntas frecuentes P: ¿Cuánta mezcla de digestión con ARNasa 4 y reparación del extremo 3′ (NEB n.º M1288) debo usar para digerir el ARN para el mapeo de secuencias de nucleótidos por LC-MS/MS? R: La adición de 1 µl de mezcla de digestión con RNasa 4 y reparación del extremo 3′ proporciona una cobertura de secuencia máxima para hasta 20 µg de ARN transcrito in vitro sin modificar, de 1000 a 9000 nucleótidos de longitud, en una reacción de 30 µl (1X NEBuffer r1.1, 1 M de urea) incubada a 37 °C durante 1 h. Al igual que con otras RNasas utilizadas para el mapeo de secuencias por LC-MS/MS, la cantidad de RNasa 4 que se debe incluir para lograr la máxima cobertura de secuencia requiere una optimización. Generalmente, un ARN más largo y modificado requerirá la adición de más mezcla de digestión con RNasa 4 y reparación del extremo 3′ para obtener la máxima cobertura de secuencia. Para sustratos de ARN modificado, recomendamos aumentar primero la cantidad de mezcla de digestión con RNasa 4 y reparación del extremo 3′ de 1 µl a 3 µl. P: ¿La ARNasa 4 (NEB n.° M1284) corta el ARN en sitios distintos a U/A y U/G? R: La preferencia observada de la ARNasa 4 es U|A > U|G >>> C|A. Se observa una baja actividad de C|A cuando hay altas concentraciones de ARNasa 4 en relación con el ARN diana. P: ¿Puedo usar la mezcla de digestión con ARNasa 4 y reparación del extremo 3' (NEB n.° M1288) para el análisis de ARNm de la tapa 5' dirigido por sonda de ADN? R: Recomendamos la dilución de la ARNasa 4 (NEB n.° M1284) en nuestro protocolo estándar para el análisis de ARNm de la tapa 5' dirigido por sonda de ADN. La implementación de este protocolo con la mezcla de digestión con ARNasa 4 y reparación del extremo 3' (NEB n.° M1288) provocará una dilución simultánea de T4 PNK, lo que afectará la eficiencia de la reparación del extremo 3'. Por lo tanto, actualmente recomendamos usar RNasa 4 independiente (NEB #M1284) para el análisis de ARNm de capuchón 5' dirigido por sonda de ADN. P: ¿Se puede inactivar la RNasa 4 (NEB #M1284)? R: La adición de 40 U de inhibidor de RNasa murina (NEB #M0314) o inhibidor de RNasa de placenta humana (NEB #M0307) a temperatura ambiente inhibe eficazmente la RNasa 4 después de las condiciones de digestión estándar. P: ¿Es la mezcla de digestión con RNasa 4 y reparación del extremo 3' (NEB #M1288) sensible a las modificaciones del ARN? R: Se han probado muchas modificaciones de uridina con una disminución mínima en las actividades de RNasa 4 y T4 PNK 3', incluidas las especies pseudo-, N1-metil-pseudo-, 5-metoxi y dihidrouridina (ψ, m1ψ, mo5U y D). Para digerir eficientemente los ARN que contienen estas modificaciones, especialmente m1ψ, recomendamos aumentar el volumen añadido. Dado que la actividad endonucleolítica de la ARNasa 4 requiere el 2'-hidroxilo del nucleótido de uridina, modificaciones como la 2'-O-metiluridina (Um) en el sitio de escisión inhiben completamente la actividad de la ARNasa 4. P: ¿Afecta la estructura secundaria del ARN a la actividad de la ARNasa 4 (NEB #M1288)? R: Para una cobertura óptima del mapeo de la secuencia de nucleótidos, se recomienda realizar digestos de ARNasa 4 en condiciones desnaturalizantes para limitar la posible influencia de la estructura secundaria del ARN. Una reacción de digestión con una concentración final de urea de 1 M, incubada a 37 °C durante 1 h, garantizará que la mayor parte del ARN esté disponible para la escisión endonucleolítica. La actividad endoribonucleasa de la ARNasa 4 tolera hasta 3 M de urea o 50 % de formamida (v/v). La actividad de reparación de extremos de la polinucleótido quinasa T4 tolera hasta 3 M de urea o 25 % de formamida (v/v). P: ¿Requiere magnesio la mezcla de digestión con RNasa 4 y reparación de extremos 3′ (NEB n.° M1288)? R: Recomendamos el uso del NEBuffer r1.1 incluido para las digestiones de ARN con la mezcla de digestión con RNasa 4 y reparación de extremos 3′, siguiendo nuestro protocolo de digestión recomendado. La actividad de reparación de extremos 3′ de la polinucleótido quinasa T4 requiere magnesio para una eliminación eficiente del fosfato. Sin embargo, cabe destacar que, al igual que la RNasa A, la RNasa 4 no requiere magnesio para la actividad endorribonucleasa. P: ¿Podrían explicarme más sobre el cambio de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los NEBuffers? A: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan albúmina recombinante. Creemos que dejar de usar productos con ingredientes de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.