Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, M1524S, TET2

Categorías relacionadas Enzimas modificadoras de bases,, Análisis de metilación del ADN,, Enzimas modificadoras de ADN y tecnologías de clonación Especificación Materiales necesarios pero no suministrados Kit de limpieza de ADN y PCR Monarch (NEB n.º T1130) o proteinasa K termolábil (NEB n.º P8111) Agua sin nucleasas (NEB n.º B1500) Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para modificar 1,4 pmol de un dúplex de oligonucleótidos de 21 meros marcado con fluorescencia que contiene una fracción CpG metilada central en un volumen de reacción total de 20 μl en 1 hora a 37 °C. Condiciones de reacción Tampón de reacción TET2 1X Incubar a 37 °C Inactivación por calor Sin unidad Condiciones del ensayo Un oligonucleótido de dsADN marcado con fluorescencia que contiene un único 5 mC se incuba con 1 unidad de TET2 en tampón de reacción TET2 1X (que contiene suplemento y Fe2+). 1 unidad de TET2 debe modificar ≥80% de 1,75 pmol de sustrato según lo determinado por electroforesis capilar. Preguntas frecuentes P: ¿Puede el TET2 (NEB #M1524) inactivarse por calor? R: No, el TET2 no se inactiva fácilmente por calor. El TET2 puede eliminarse de la reacción utilizando una columna para limpieza (como el Monarch® PCR & DNA Cleanup Kit, (NEB #T1130) o por tratamiento con proteinasa K termolábil (NEB #P8111)). P: ¿Puede la solución de Fe(II) recién diluida almacenarse a largo plazo? R: No. La solución de Fe(II) recién diluida debe desecharse inmediatamente después de su uso. P: ¿Puede el suplemento de tampón de reacción 1X TET2 reconstituido (suministrado con NEB #M1524) almacenarse durante más de 4 meses? R: No, el suplemento de tampón de reacción 1X TET2 reconstituido debe desecharse después de 4 meses. Se recomienda registrar la fecha de reconstitución en el vial. P: ¿TET2 (NEB n.º M1524) muestra alguna preferencia de secuencia? R: Sí, TET2 puede mostrar cierta preferencia de secuencia, pero solo a bajas concentraciones de enzima (p. ej., la actividad más alta en un contexto CpG en relación con un contexto CHH o CHG). Las preferencias de secuencia se pueden superar utilizando al menos 8 U (1 µl de enzima). P: ¿Cuánto tiempo se puede almacenar el suplemento de tampón de reacción TET2 liofilizado (suministrado con NEB n.º M1524)? R: A -20 °C, el suplemento de tampón de reacción TET2 liofilizado permanece viable hasta dos años. Sin embargo, una vez reconstituido en tampón de reacción TET2 5X, el suplemento de tampón de reacción TET2 debe desecharse después de 4 meses de almacenamiento a -20 °C. P: ¿Es normal que la solución de Fe(II) sea amarilla o se observe un cambio de color? R: Sí, se ha observado variación de color (de incoloro a amarillo). Las pruebas no han mostrado ninguna diferencia en el rendimiento en función de esta variación. P: ¿TET2 (NEB #M1524) es activo en sustratos metilados asimétricamente? R: Sí, el estado de metilación de la cadena complementaria no afecta la actividad de TET2. P: ¿TET2 (NEB #M1524) es activo en ARN metilado? R: No, TET2 no es activo ni en ARN monocatenario ni bicatenario. P: ¿TET2 (NEB #M1524) es activo en ADN monocatenario metilado? R: Sí, TET2 es activo tanto en ADN monocatenario como bicatenario, con preferencia por el ADN bicatenario. P: ¿TET2 (NEB #M1524) es inhibido por EDTA? R: Sí, el EDTA inhibe la actividad de TET2. Recomendamos mantener las concentraciones de EDTA por debajo de 0,01 mM (final) en la reacción de TET2. P: ¿La sal inhibe la TET2 (NEB #M1524)? R: Sí, la sal inhibe la TET2. Recomendamos mantener las concentraciones de sal por debajo de 50 mM (final) en la reacción de TET2. P: ¿Cuál es la actividad de TET2 (NEB #M1524) en otros tampones? R: El tampón de reacción TET2 está formulado específicamente para una actividad óptima de TET2. No se recomienda el uso de otros tampones con TET2. P: ¿Cuál es el rango de temperatura de reacción de TET2 (NEB #M1524)? R: La TET2 es activa a temperaturas entre 4 y 60 °C, siendo 37 °C el valor óptimo.