New England Biolabs, M1708L, Mezcla maestra multiusos WarmStart® LAMP/RT-LAMP 2X (con UDG)

Categorías relacionadas Amplificación isotérmica y desplazamiento de hebra,, Mezclas maestras Aplicaciones Amplificación isotérmica mediada por bucle Especificación Materiales necesarios pero no suministrados Cebadores LAMP (recomendamos usar la herramienta de diseño de cebadores NEB LAMP) Muestras de ácidos nucleicos diana H2O de grado de biología molecular Bloque térmico, baño de agua, turbidímetro o termociclador en tiempo real (con medición de fluorescencia en tiempo real si se desea) y recipientes de reacción apropiados para el instrumento Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la temperatura óptima de amplificación LAMP/RT-LAMP? R: Recomendamos 65 °C como temperatura inicial de LAMP. Sin embargo, es posible realizar reacciones LAMP y RT-LAMP de 55 a 70 °C, dependiendo de la naturaleza del conjunto de cebadores y los objetivos. P: ¿Cuál es la concentración de Mg++ en la mezcla maestra WarmStart LAMP/RT-LAMP? R: La mezcla maestra 2X contiene 16 mM de MgSO4 y, por lo tanto, 8 mM de MgSO4 en la reacción final 1X. P: ¿Qué tipos de muestras/materiales de entrada son compatibles con las mezclas LAMP/RT-LAMP? R: LAMP suele ser una técnica robusta y tolerante a inhibidores, y la mezcla maestra WarmStart® LAMP/RT-LAMP permite la amplificación directa con diversos tipos de muestras. Para obtener la máxima especificidad y sensibilidad, recomendamos ácido nucleico purificado como entrada. La mayoría de los métodos rutinarios de purificación de plantillas son suficientes, como los kits de extracción de ácidos nucleicos Monarch®. Sugerimos utilizar 2 µl de ácido nucleico extraído para una reacción LAMP de 25 µl. Se pueden tolerar volúmenes de muestra mayores o menores. Las muestras en medios de transporte (VTM o UTM) deben mantenerse a menos de 2 µl (8 % v/v). P: ¿Con qué rapidez puedo obtener el resultado? R: La amplificación del objetivo variará en función de diversos factores, como el diseño del cebador (recomendamos utilizar la herramienta de diseño de cebadores NEB LAMP), la pureza y la cantidad de la plantilla. Sugerimos comenzar con un tiempo de incubación de 30 minutos. Si se desea, el tiempo se puede acortar a 15-20 minutos con ensayos optimizados o dianas con alto número de copias. Alternativamente, se puede extender hasta 60 minutos para insumos bajos, muestras impuras o ensayos más lentos. Tenga en cuenta que al extender el tiempo de reacción, también se deben monitorear los NTC para garantizar que no haya falsos positivos. P: ¿Puedo configurar mis reacciones LAMP/RT-LAMP a temperatura ambiente? R: Sí, las enzimas Bst ADN polimerasa y transcriptasa inversa utilizadas en esta mezcla maestra son formulaciones WarmStart®, por lo que son inhibidas por aptámeros modificados a temperatura ambiente. En consecuencia, las reacciones se pueden preparar a temperatura ambiente sin afectar significativamente la actividad LAMP. Para obtener información adicional sobre la modulación de la actividad enzimática a temperatura ambiente con aptámeros, consulte "Uso de aptámeros para controlar las actividades enzimáticas: Hot Start Taq y más allá". P: La mezcla maestra WarmStart LAMP tiene algo de precipitación en el tubo después de la descongelación, ¿es esto normal? R: Sí, la precipitación de las mezclas maestras LAMP después de la congelación/descongelación es normal. Es importante resuspender la mezcla mediante agitación o vórtex completos para disolver todo el precipitado. Tras la suspensión, las mezclas maestras pueden utilizarse con normalidad. P: ¿Cómo se diseñan los cebadores LAMP? R: Diseñar manualmente los cebadores LAMP puede ser complicado, por lo que se recomienda encarecidamente el uso de programas informáticos tanto por su facilidad de diseño como por la probabilidad de éxito de la reacción. Recomendamos utilizar la herramienta de diseño de cebadores LAMP de NEB. Dado que el rendimiento y los niveles de amplificación sin molde pueden variar incluso con el diseño in silico, recomendamos evaluar de 2 a 4 conjuntos completos de cebadores LAMP para obtener una sensibilidad y especificidad óptimas antes de elegir el conjunto definitivo. Para obtener una descripción general del diseño y la utilización de los cebadores LAMP, consulte nuestro tutorial sobre la herramienta de diseño de cebadores LAMP y lea esta nota de aplicación para obtener más información. P: ¿La mezcla maestra WarmStart LAMP/RT-LAMP 2X (con UDG) permite prevenir el arrastre/reducir la contaminación? R: Sí, la mezcla maestra WarmStart LAMP/RT-LAMP 2X (con UDG) está formulada con una mezcla de dTTP y dUTP. Esto asegura tanto la amplificación isotérmica eficiente como la incorporación de dU en los productos de reacción. La mezcla también contiene UDG termolábil antártico (NEB #M0372). Los productos LAMP que contienen dU sirven como sustrato para la uracilo ADN glicosilasa, lo que permite la prevención de la contaminación por arrastre. Las reacciones deben configurarse a temperatura ambiente (normalmente 22-25 °C) antes de la incubación isotérmica para permitir que los amplicones que contienen dU se degraden, o si se desea, una incubación de 10 minutos a 25 °C antes de que se pueda añadir LAMP al flujo de trabajo. Debido a que LAMP puede generar grandes cantidades de ADN en períodos de tiempo muy cortos, las mejores prácticas para reducir la contaminación implican no abrir las reacciones LAMP después de la amplificación. P: Se produjo amplificación en mi(s) muestra(s) de NTC después de la incubación isotérmica. ¿Qué ocurrió? R: La amplificación en el control sin molde en 30 minutos puede indicar contaminación cruzada durante la configuración de la reacción o un problema sistémico. Algunos conjuntos de cebadores son más susceptibles a la amplificación no específica que otros. Recomendamos evaluar al menos dos conjuntos de cebadores LAMP para cualquier diana. Además, algunos formatos de reacción o flujos de trabajo pueden ser más propensos a la amplificación no específica con conjuntos de cebadores particulares, como: Grandes volúmenes de reacción en recipientes pequeños (p. ej., 20 µL en placas de 384 pocillos) Bajas temperaturas de reacción (p. ej., 60 °C en lugar de 65 °C) Si se utiliza un termociclador en tiempo real, se puede incluir una curva de fusión o desnaturalización después de la incubación LAMP para distinguir entre la amplificación espuria y la contaminación cruzada, ya que cada amplicón LAMP producirá un perfil de fusión único. Si la reacción NTC es positiva tras repetir la prueba o cambiar el flujo de trabajo, reemplace todas las existencias de reactivos y limpie el espacio de trabajo con un descontaminante de superficie aceptable, como lejía al 10 % (dilución 1:10 de hipoclorito de sodio comercial al 5,25-6,0 %). P: ¿Qué métodos de detección se pueden utilizar para los experimentos LAMP/RT-LAMP? R: La mezcla maestra LAMP es compatible con diversas opciones de visualización/detección, como turbidez, fluorescencia, métodos colorimétricos sin pH (p. ej., azul de hidroxinaftol) y métodos en gel. Los kits LAMP (NEB n.° E1700 y NEB n.° E1708) incluyen un colorante fluorescente LAMP 50X que se une al ADN bicatenario para la detección de fluorescencia en tiempo real. P: ¿Cuáles son las ventajas de usar LAMP estándar (NEB n.° M1712, E1700, M1708, E1708) en comparación con LAMP colorimétrico basado en pH (NEB n.° M1800, M1804)? R: Nuestras mezclas maestras LAMP colorimétricas basadas en pH (NEB n.° M1800, NEB n.° M1804) utilizan una solución tamponada débilmente para permitir la detección visual con un colorante sensible al pH. Esta sencilla lectura visual puede ser especialmente útil para las pruebas en el punto de necesidad. Sin embargo, la baja capacidad de tamponamiento requerida para desencadenar el cambio de color de rosa a amarillo limita la compatibilidad de la muestra, ya que las entradas de muestra altamente tamponadas o las muestras ácidas pueden afectar el cambio de color. Las mezclas maestras en nuestros productos LAMP estándar (NEB #M1712, NEB #E1700, NEB #M1708, NEB #E1708) pueden tolerar mejor este tipo de entradas de muestra. Estos productos también son compatibles con la detección colorimétrica no basada en el pH. Las mezclas maestras LAMP/RT-LAMP de NEB permiten opciones con respecto al tipo de muestra y el cambio de color visual. Las mezclas maestras LAMP colorimétricas basadas en el pH de NEB con UDG (NEB #M1804) o sin UDG (NEB #M1800) están débilmente tamponadas para permitir la detección visual de la amplificación utilizando rojo de fenol, que es un colorante sensible al pH. La baja capacidad de tamponamiento permite que el pH de la reacción disminuya a medida que se producen protones de la amplificación del ácido nucleico diana, generando un cambio de color de rosa a amarillo. Esta sencilla lectura visual puede ser especialmente útil para las pruebas en el punto de necesidad. Sin embargo, la baja capacidad de tamponamiento requerida para la detección basada en pH limita la compatibilidad de las muestras con las mezclas colorimétricas LAMP basadas en pH. Las muestras de entrada altamente tamponadas pueden inhibir el cambio de color, mientras que las muestras ácidas pueden disminuir el pH de la reacción lo suficiente como para afectar el color inicial. La mezcla maestra multipropósito LAMP/RT-LAMP 2X con UDG (NEB #M1708, NEB #E1708) o sin UDG (NEB #E1700) está completamente tamponada y tolera mejor este tipo de muestras de entrada, lo que la hace compatible con otros colorantes colorimétricos (p. ej., azul de hidroxinaftol, un indicador metálico). P: ¿Se requiere un paso de incubación independiente para RT-LAMP? R: No se requiere un paso de transcripción inversa independiente para realizar RT-LAMP, ya que la transcriptasa inversa WarmStart RTx producirá ADNc durante la incubación isotérmica a 65 °C. P: ¿Qué tipo de purificación se recomienda para los cebadores LAMP? R: Al cribar múltiples conjuntos de cebadores LAMP para identificar los que ofrecen el rendimiento óptimo para un objetivo determinado, la desalinización estándar suele ser suficiente. Sin embargo, recomendamos la purificación por PAGE o HPLC de los cebadores FIP y BIP como mínimo para el ensayo final a fin de garantizar la robustez en cuanto al tiempo de detección y la sensibilidad.