New England Biolabs, M1712S, Bst-XT WarmStart™ Mezcla maestra multiusos LAMP/RT-LAMP 2X (con UDG)

Categorías relacionadas Amplificación isotérmica y desplazamiento de hebra Aplicaciones Amplificación isotérmica,, Amplificación de ADN, PCR y qPCR Especificación Materiales necesarios pero no suministrados Dispositivo de calentamiento: bloque de calor, baño de agua o fluorímetro en tiempo real (instrumento qPCR) configurado a 65 °C Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la concentración de Mg++ en la mezcla maestra Bst-XT LAMP/RT-LAMP? R: La mezcla maestra 2X contiene 14 mM de MgSO4, por lo tanto, 7 mM de MgSO4 en la reacción final 1X. P: ¿Cuál es la temperatura óptima de amplificación LAMP/RT-LAMP mientras se utiliza la mezcla maestra Bst-XT LAMP/RT-LAMP? R: Recomendamos realizar reacciones LAMP a 65 °C. Sin embargo, es posible realizar reacciones LAMP y RT-LAMP de 50 a 70 °C, dependiendo de la naturaleza del conjunto de cebadores y el objetivo. P: ¿La mezcla maestra Bst-XT WarmStart Multi-Purpose LAMP/RT-LAMP 2X (con UDG) previene la contaminación por arrastre y reduce la contaminación? R: Sí, la mezcla maestra Bst-XT WarmStart Multi-Purpose LAMP/RT-LAMP 2X (con UDG) está formulada con una mezcla de dTTP y dUTP. Esto garantiza una amplificación isotérmica eficiente y la incorporación de dU en los productos de reacción. La mezcla también contiene UDG termolábil antártico (NEB n.° M0372). En reacciones posteriores, los productos LAMP que contienen dU sirven como sustrato para la UDG (uracilo ADN glicosilasa), lo que permite prevenir la contaminación por arrastre. La actividad de la UDG durante la configuración destruirá rápida y eficazmente cualquier producto contaminante. Dado que la LAMP puede generar grandes cantidades de ADN en muy poco tiempo, las mejores prácticas para reducir la contaminación consisten en evitar abrir las reacciones LAMP después de la amplificación. P: ¿Con qué rapidez se obtienen los resultados al usar la mezcla maestra Bst-XT LAMP/RT-LAMP? R: La amplificación del objetivo variará en función de diversos factores, como la pureza y la cantidad de la plantilla, y el diseño del cebador (recomendamos la herramienta de diseño de cebadores NEB LAMP). Sugerimos comenzar con un tiempo de incubación de 20 minutos. Si se desea, se puede reducir a 15 minutos con ensayos optimizados o objetivos con un alto número de copias. Como alternativa, se puede prolongar hasta 40 minutos para entradas bajas, muestras impuras o ensayos más lentos. Tenga en cuenta que al extender el tiempo de reacción, también se deben monitorizar los NTC para evitar falsos positivos. P: ¿Qué métodos de detección son compatibles con la mezcla maestra Bst-XT LAMP/RT-LAMP? R: La mezcla maestra Bst-XT LAMP/RT-LAMP es compatible con diversos métodos de visualización/detección, como fluorescencia, turbidez y detección colorimétrica de punto final mediante ciertos colorantes de detección de metales (p. ej., calceína con manganeso o negro de eriocromo T). Esta mezcla maestra también es compatible con la evaluación en gel y los métodos de flujo lateral. Tenga en cuenta que no se recomienda el uso de azul de hidroxinaftol con esta mezcla maestra, ya que el cambio de color resultante no es perceptible. Si la reacción se va a monitorizar en tiempo real, se puede incluir el colorante fluorescente LAMP (NEB n.° B1700) a una concentración final de 0,5X para monitorizar la reacción en un canal SYBR/FAM del instrumento de PCR en tiempo real. El colorante se puede titular según sea necesario entre 0,1X y 1X. P: ¿Cuáles son las ventajas de usar LAMP estándar (NEB n.° M1712, E1700, M1708, E1708) en lugar de LAMP colorimétrico basado en pH (NEB n.° M1800, M1804)? R: Nuestras mezclas maestras LAMP colorimétricas basadas en pH (NEB n.° M1800, NEB n.° M1804) utilizan una solución débilmente tamponada para permitir la detección visual con un colorante sensible al pH. Esta sencilla lectura visual puede ser especialmente útil para las pruebas en el punto de necesidad. Sin embargo, la baja capacidad de tamponamiento requerida para desencadenar el cambio de color de rosa a amarillo limita la compatibilidad de la muestra, ya que las entradas de muestra altamente tamponadas o las muestras ácidas pueden afectar el cambio de color. Las mezclas maestras en nuestros productos LAMP estándar (NEB #M1712, NEB #E1700, NEB #M1708, NEB #E1708) pueden tolerar mejor este tipo de entradas de muestra. Estos productos también son compatibles con la detección colorimétrica no basada en el pH. Las mezclas maestras LAMP/RT-LAMP de NEB permiten opciones con respecto al tipo de muestra y el cambio de color visual. Las mezclas maestras LAMP colorimétricas basadas en el pH de NEB con UDG (NEB #M1804) o sin UDG (NEB #M1800) están débilmente tamponadas para permitir la detección visual de la amplificación utilizando rojo de fenol, que es un colorante sensible al pH. La baja capacidad de tamponamiento permite que el pH de la reacción disminuya a medida que se producen protones de la amplificación del ácido nucleico diana, generando un cambio de color de rosa a amarillo. Esta sencilla lectura visual puede ser especialmente útil para las pruebas puntuales. Sin embargo, la baja capacidad de tamponamiento requerida para la detección basada en pH limita la compatibilidad de las muestras con las mezclas colorimétricas LAMP basadas en pH. Las muestras altamente tamponadas pueden inhibir el cambio de color, mientras que las muestras ácidas pueden disminuir el pH de la reacción lo suficiente como para afectar el color inicial. La mezcla maestra multipropósito LAMP/RT-LAMP 2X con UDG (NEB #M1708, NEB #E1708) o sin UDG (NEB #E1700) está completamente tamponada y tolera mejor este tipo de muestras, lo que la hace compatible con otros colorantes colorimétricos (p. ej., azul de hidroxinaftol, un indicador metálico). P: ¿Puedo preparar mis reacciones LAMP/RT-LAMP a temperatura ambiente? R: Sí, las enzimas Bst ADN polimerasa y transcriptasa inversa utilizadas en esta mezcla maestra son formulaciones WarmStart®, por lo que son inhibidas por aptámeros modificados a temperatura ambiente. Por lo tanto, las reacciones pueden prepararse a temperatura ambiente sin afectar significativamente la actividad LAMP. Para obtener información adicional sobre la modulación de la actividad enzimática a temperatura ambiente con aptámeros, consulte "Uso de aptámeros para controlar las actividades enzimáticas: Hot Start Taq y más allá". P: ¿Cómo diseño cebadores LAMP? R: Los cebadores LAMP pueden ser difíciles de diseñar manualmente, y se recomiendan encarecidamente los programas de software tanto por la facilidad de diseño como por la probabilidad de éxito de la reacción. Recomendamos utilizar la herramienta de diseño de cebadores NEB LAMP. Dado que el rendimiento y los niveles de amplificación no molde pueden variar incluso con el diseño in silico, recomendamos evaluar de 2 a 4 conjuntos completos de cebadores LAMP para obtener una sensibilidad y especificidad óptimas antes de elegir el conjunto final. Para obtener una descripción general de cómo se diseñan y utilizan los cebadores LAMP, vea nuestro tutorial de la herramienta de diseño de cebadores LAMP y lea esta nota de aplicación para obtener más detalles. P: Se produjo una amplificación en mi(s) muestra(s) de NTC después de la incubación isotérmica. ¿Qué ocurrió? R: La amplificación en el control no molde en un plazo de 30 minutos puede indicar contaminación cruzada durante la configuración de la reacción o un problema sistémico. Algunos conjuntos de cebadores son más susceptibles a la amplificación no específica que otros. Recomendamos evaluar al menos dos conjuntos de cebadores LAMP para cualquier diana. Además, algunos formatos de reacción o flujos de trabajo pueden ser más propensos a la amplificación no específica con conjuntos de cebadores particulares, como: Grandes volúmenes de reacción en recipientes pequeños (p. ej., 20 µL en placas de 384 pocillos) Bajas temperaturas de reacción (p. ej., 60 °C en lugar de 65 °C) Si se utiliza un termociclador en tiempo real, se puede incluir una curva de fusión o desnaturalización después de la incubación LAMP para distinguir entre la amplificación espuria y la contaminación cruzada, ya que cada amplicón LAMP producirá un perfil de fusión único. Si la reacción NTC es positiva tras repetir la prueba o cambiar el flujo de trabajo, reemplace todas las existencias de reactivos y limpie el espacio de trabajo con un descontaminante de superficie aceptable, como lejía al 10 % (dilución 1:10 de hipoclorito de sodio comercial al 5,25-6,0 %). P: ¿Se requiere un paso de incubación independiente para RT-LAMP? R: No es necesario un paso de transcripción inversa independiente para realizar la RT-LAMP, ya que la transcriptasa inversa WarmStart RTx producirá ADNc durante la incubación isotérmica a 65 °C. P: ¿Qué tipo de purificación se recomienda para los cebadores LAMP? R: Al cribar varios conjuntos de cebadores LAMP para identificar los que ofrecen un rendimiento óptimo para una diana determinada, la desalinización estándar suele ser suficiente. Sin embargo, recomendamos la purificación por PAGE o HPLC de los cebadores FIP y BIP como mínimo para el ensayo final para garantizar la robustez con respecto al tiempo de detección y la sensibilidad. P: La mezcla maestra WarmStart LAMP presenta algo de precipitación en el tubo después de la descongelación, ¿es esto normal? R: Sí, la precipitación de las mezclas maestras LAMP después de la congelación/descongelación es normal. Es importante resuspender la mezcla mezclándola bien o agitándola en vórtex para disolver todo el material precipitado, pero después de la suspensión, las mezclas maestras se pueden utilizar de forma normal.