New England Biolabs, M1804L, Mezcla maestra colorimétrica WarmStart® LAMP 2X con UDG

Solución simple de un solo paso para la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) de dianas de ADN o ARN (RT-LAMP) Categorías relacionadas Amplificación isotérmica y desplazamiento de hebra, PCR, qPCR y tecnologías de amplificación Aplicaciones Amplificación isotérmica mediada por bucle, Amplificación isotérmica, Amplificación de ADN, PCR y qPCR Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la diferencia entre usar reacciones LAMP colorimétricas y LAMP regulares? R: Nuestra tecnología LAMP colorimétrica basada en pH se basa en el mismo principio de la amplificación LAMP y RT-LAMP, pero ha sido diseñada para permitir la detección visual de reacciones positivas. Las mezclas maestras WarmStart Colorimetric LAMP 2X contienen el colorante rojo fenol sensible al pH en una solución de reacción de bajo tampón que cambia de color de rosa brillante a amarillo tras la amplificación del ADN (debido a la liberación de un protón por nucleótido incorporado). Esta detección permite utilizar equipos simples (p. ej., agua caliente para incubación, detección visual) en lugar de instrumentos sofisticados y costosos para las reacciones LAMP. P: ¿Cuánto tiempo debo incubar la reacción LAMP colorimétrica antes de comprobar los resultados? R: Nuestro tiempo de incubación recomendado para LAMP colorimétrica es de 30 minutos. En este punto final, la mayoría de las reacciones LAMP positivas habrán cambiado de color y los controles sin molde serán negativos. Si se desea, el tiempo puede acortarse a 15-20 minutos con buenos ensayos o dianas con un alto número de copias, o prolongarse hasta 60 minutos con un aporte muy bajo, muestras impuras y ensayos más lentos. Si se optimiza el tiempo de reacción, el progreso puede comprobarse simplemente observando los colores de la reacción e incubando durante más tiempo si la reacción es incompleta. Tenga en cuenta que al ampliar el tiempo de reacción, también deben monitorizarse los NTC para garantizar que no haya falsos positivos. P: ¿Qué tampón debo usar para las muestras diana y los cebadores que se van a utilizar en la reacción LAMP colorimétrica? R: Recomendamos disolver o diluir el ADN o ARN diana en H₂O y añadir de 1 a 5 µl a 25 µl de reacciones LAMP. Se puede usar el tampón TE (Tris 10 mM, EDTA 1,0 mM, pH 7,5-8,0), pero no se deben añadir dianas disueltas en TE en volúmenes superiores a 1-2 µl (o <10 % del volumen final). De igual forma, cualquier muestra almacenada en una solución alcalina (pH superior a 8,5) o ácida (pH inferior a 7) no debe representar más del 10 % del volumen final de la reacción, ya que una cantidad mayor puede afectar la detección basada en el pH. Si se necesitan >5 µl para un número de copias suficiente, use agua o una solución 0,1X de tampón de muestra. P: ¿Cuál es la concentración de Mg++ en la mezcla maestra colorimétrica LAMP 2X? R: La mezcla 2X contiene 16,0 mM de MgSO4 y, por lo tanto, 8,0 mM de MgSO4 en la reacción final 1X. P: ¿Se puede utilizar la mezcla maestra colorimétrica LAMP 2X en instrumentos que utilizan detección fluorescente de amplificación de ADN o medición de turbidez en tiempo real? R: La mezcla maestra es compatible con métodos de detección fluorescente cuando se complementa con colorantes fluorescentes intercalantes de ADN y proporciona una velocidad de reacción similar a la de un LAMP convencional. También es posible realizar la detección LAMP en un turbidímetro en tiempo real, aunque su velocidad de reacción es ligeramente inferior a la de un LAMP convencional. P: ¿Qué tan estables son las mezclas maestras colorimétricas WarmStart LAMP 2X? R: Las mezclas colorimétricas LAMP son estables en condiciones de uso y manipulación estándar. Contienen una baja concentración de Tris pH 8 y el rojo de fenol, sensible al pH, muestra un color rosa brillante cerca de este pH. Tras el uso repetido del mismo tubo, es posible que se produzca una ligera disminución del pH, pero normalmente no afectará al rendimiento de la reacción, siempre que la mezcla siga siendo rosada antes de la amplificación. Ocasionalmente, tras múltiples usos y una exposición prolongada al aire, el pH puede descender por debajo de pH 7 y la mezcla adquirirá un color entre naranja claro y amarillo antes de su uso. Este cambio de color indica visualmente que la solución ya no es apta para la reacción colorimétrica LAMP. Por lo tanto, se recomienda evitar la exposición prolongada al aire cerrando las tapas de los tubos y almacenando la mezcla maestra en el vial que la contenía (o en viales similares con juntas tóricas) a -20 °C. Si la mezcla maestra se pipetea en tubos de tira, tubos de PCR o similares, recomendamos utilizar el material el mismo día. P: ¿Cómo diseño cebadores LAMP? R: Diseñar manualmente los cebadores LAMP puede ser complicado, por lo que se recomienda encarecidamente el uso de programas informáticos tanto para facilitar el diseño como para garantizar el éxito de la reacción. Recomendamos utilizar la herramienta de diseño de cebadores LAMP de NEB. Dado que el rendimiento y los niveles de amplificación sin molde pueden variar incluso con el diseño in silico, recomendamos evaluar de 2 a 4 conjuntos completos de cebadores LAMP para obtener una sensibilidad y especificidad óptimas antes de elegir el conjunto definitivo. Para obtener una visión general del diseño y el uso de los cebadores LAMP, consulte nuestro tutorial sobre la herramienta de diseño de cebadores LAMP y lea esta nota de aplicación para obtener más información. P: La mezcla maestra WarmStart LAMP presenta cierta precipitación en el tubo después de descongelarla. ¿Es normal? R: Sí, la precipitación de las mezclas maestras LAMP después de congelarlas/descongelarlas es normal. Es importante resuspender la mezcla mezclándola bien o agitándola en vórtex para disolver todo el precipitado; sin embargo, después de la suspensión, las mezclas maestras pueden usarse con normalidad. P: ¿Cuál es la diferencia entre la mezcla maestra WarmStart® Colorimetric LAMP 2X con UDG (NEB n.° M1804) y la mezcla maestra WarmStart Colorimetric LAMP 2X (ADN y ARN) (NEB n.° M1800)? R: Ambas mezclas maestras WarmStart Colorimetric LAMP 2X contienen un colorante sensible al pH en una solución de reacción con bajo contenido de tampón que cambia de color de rosa brillante a amarillo tras la amplificación del ADN. Esta sencilla detección visual, combinada con una incubación a una sola temperatura, permite utilizar equipos menos sofisticados (bloques térmicos, incubadoras, etc.) que con las reacciones LAMP típicas. La mezcla maestra colorimétrica WarmStart® LAMP 2X con UDG es una versión modificada de M1800 que contiene dUTP y UDG termolábil antártico (NEB n.° M0372), lo que evita la amplificación de productos de reacciones anteriores que contienen uracilo. Estas adiciones reducen la posibilidad de contaminación por arrastre (donde el producto de una reacción previa puede servir inesperadamente como sustrato de una reacción posterior). Ambas mezclas contienen WarmStart Bst 2.0® y WarmStart RTx y pueden usarse para amplificar dianas de ARN y ADN/ADNc. P: ¿Qué sucede si mi mezcla colorimétrica LAMP es naranja en lugar de rosa antes de la amplificación? R: Las mezclas colorimétricas LAMP son estables en condiciones estándar de manipulación y uso. Contienen una baja concentración de Tris pH 8 y el rojo fenol sensible al pH muestra un color rosa brillante cerca de este pH. Tras el uso repetido del mismo tubo, es posible que se produzca una ligera disminución del pH, pero normalmente no afectará al rendimiento de la reacción, siempre que la mezcla siga siendo rosa antes de la amplificación. Ocasionalmente, después de múltiples usos y una exposición prolongada al aire, el pH puede descender por debajo de 7 y la mezcla adquirirá un color naranja claro a amarillo antes de su uso. Este cambio de color indica visualmente que la solución ya no es apta para la reacción colorimétrica LAMP. Por lo tanto, se recomienda evitar la exposición prolongada al aire cerrando las tapas de los tubos y almacenando la mezcla maestra en el vial que la contenía (o en viales similares con juntas tóricas) a -20 °C. Si la mezcla maestra se pipetea en tubos de tira, tubos de PCR o similares, recomendamos utilizar el material el mismo día. P: ¿La mezcla maestra colorimétrica LAMP WarmStart® con UDG permite prevenir el arrastre/reducir la contaminación? R: Sí, la mezcla maestra colorimétrica LAMP WarmStart® con UDG está formulada con una mezcla de dTTP y dUTP. Esto garantiza tanto una amplificación isotérmica eficiente como la incorporación de dU en los productos de reacción. La mezcla también contiene UDG termolábil antártico (NEB n.° M0372). Los productos LAMP que contienen dU sirven como sustrato para la uracilo ADN glicosilasa, lo que permite prevenir la contaminación por arrastre. Las reacciones deben configurarse a temperatura ambiente (normalmente 22-25 °C) antes de la incubación isotérmica a 65 °C para permitir la degradación de los amplicones que contienen dU o, si se desea, una incubación de 10 minutos a 25 °C antes de poder añadir LAMP al flujo de trabajo. Dado que LAMP puede generar grandes cantidades de ADN en periodos muy cortos, las mejores prácticas para reducir la contaminación consisten en no abrir las reacciones LAMP después de la amplificación. P: ¿Cuánta muestra se puede añadir a la reacción LAMP colorimétrica como entrada? R: Para obtener los mejores resultados, recomendamos 2 µl de ácido nucleico extraído en una reacción de 25 µl. Se pueden tolerar volúmenes de muestra mayores o menores. Asegúrese de que el ácido nucleico se eluya o prepare en agua para evitar arrastrar el exceso de tampón a la reacción. El material eluido en TE o un tampón de elución similar debe mantenerse a menos de 5 µl (20 % v/v) del volumen final de la reacción. Las muestras en medios de transporte (VTM o UTM) deben mantenerse a menos de 2 µl (8 % v/v). Para aumentar el volumen de la muestra, utilice tampón de elución 0,1X o agua para la preparación del ácido nucleico. P: ¿Puedo monitorizar el cambio de color de las reacciones colorimétricas LAMP con un espectrofotómetro? R: Sí. La reacción se puede monitorizar en tiempo real o al final de la reacción como parte de un flujo de trabajo de alto rendimiento midiendo la relación de absorbancia de 432 nm/560 nm. P: ¿Qué componentes contiene la mezcla maestra colorimétrica LAMP WarmStart® con UDG y qué más necesito para realizar una reacción LAMP? R: La mezcla maestra colorimétrica WarmStart LAMP con UDG contiene un tampón de reacción con bajo contenido de Tris y todos los cofactores necesarios en concentraciones optimizadas 2X para ensayos LAMP: ADN polimerasa Bst 2.0 WarmStart®, WarmStart RTx, uracil-ADN glicosilasa termolábil antártica (UDG), dTTP/dUTP y rojo fenol para la detección de pH de LAMP. Para realizar una reacción LAMP o RT-LAMP, el usuario añade cebadores, ADN o ARN diana y ajusta la concentración final a 1X. Las instrucciones detalladas se encuentran en el protocolo. P: ¿Se pueden utilizar las mezclas maestras colorimétricas WarmStart LAMP 2X en instrumentos que utilizan detección de fluorescencia? R: La mezcla maestra colorimétrica es compatible con los métodos de detección fluorescente cuando se complementa con colorantes fluorescentes intercalantes de ADN (SYTO 9 o similar) y proporciona velocidades de reacción similares a las de LAMP convencional. Sin embargo, recomendamos usar nuestros productos LAMP estándar (NEB #E1700, E1708) cuando la lectura principal sea fluorescencia. P: ¿Cuál es la temperatura óptima de amplificación LAMP/RT-LAMP? R: Recomendamos 65 °C como temperatura inicial LAMP. Sin embargo, es posible realizar reacciones LAMP y RT-LAMP de 55 a 70 °C, dependiendo de la naturaleza del conjunto de cebadores y los objetivos. P: ¿Qué tan rápido debo esperar un resultado? R: La amplificación del objetivo variará dependiendo de una serie de factores, incluyendo el diseño del cebador (recomendamos usar la herramienta de diseño de cebadores NEB LAMP), la pureza de la plantilla y la cantidad de plantilla. Sugerimos comenzar con un tiempo de incubación de 30 minutos. Si se desea, el tiempo se puede acortar a 15-20 minutos con ensayos optimizados o objetivos de alto número de copias. Alternativamente, se puede extender hasta 60 minutos para entradas bajas, muestras impuras y/o ensayos más lentos. Tenga en cuenta que al extender el tiempo de reacción, también se deben monitorear los NTC para garantizar que no haya falsos positivos. P: ¿Puedo configurar mis reacciones LAMP/RT-LAMP a temperatura ambiente? R: Sí, las enzimas Bst ADN polimerasa y transcriptasa inversa utilizadas en esta mezcla maestra son formulaciones WarmStart®, por lo que son inhibidas por aptámeros modificados a temperatura ambiente. En consecuencia, las reacciones se pueden preparar a temperatura ambiente sin afectar significativamente la actividad LAMP. Para obtener información adicional sobre la modulación de la actividad enzimática a temperatura ambiente con aptámeros, consulte "Uso de aptámeros para controlar las actividades enzimáticas: Hot Start Taq y más allá". P: Se produjo una amplificación en mi(s) muestra(s) de NTC después de la incubación isotérmica. ¿Qué sucedió? R: La amplificación en el control sin molde dentro de los 30 minutos puede indicar contaminación cruzada durante la configuración de la reacción o un problema sistémico. Algunos conjuntos de cebadores son más susceptibles a la amplificación no específica que otros. Recomendamos evaluar al menos dos conjuntos de cebadores LAMP para cada diana. Además, algunos formatos de reacción o flujos de trabajo pueden ser más propensos a la amplificación no específica con conjuntos de cebadores particulares, como: Grandes volúmenes de reacción en recipientes pequeños (p. ej., 20 uL en placas de 384 pocillos) Bajas temperaturas de reacción (p. ej., 60 °C en lugar de 65 °C) Si se utiliza un termociclador en tiempo real, se puede incluir una curva de fusión o desnaturalización después de la incubación con LAMP para distinguir entre la amplificación espuria y la contaminación cruzada, ya que cada amplicón LAMP producirá un perfil de fusión único. Si la reacción NTC es positiva tras repetir la prueba o cambiar el flujo de trabajo, reemplace todas las existencias de reactivos y limpie el espacio de trabajo con un descontaminante de superficie aceptable, como lejía al 10 % (dilución 1:10 de hipoclorito de sodio comercial al 5,25-6,0 %). P: ¿Se requiere un paso de incubación independiente para RT-LAMP? R: No es necesario un paso de transcripción inversa independiente para realizar la RT-LAMP, ya que la transcriptasa inversa WarmStart RTx producirá ADNc durante la incubación isotérmica a 65 °C. P: ¿Debo usar clorhidrato de guanidina (B2619A) en reacciones LAMP colorimétricas? R: Recomendamos que las reacciones LAMP colorimétricas contengan una concentración final de 40 mM de clorhidrato de guanidina y, en consecuencia, proporcionarla para su adición a la reacción LAMP en el flujo de trabajo estándar del SARS-CoV-2. Sin embargo, algunos flujos de trabajo de preparación de muestras anteriores pueden introducir una fuente de guanidina en la muestra que puede transportarse a la reacción LAMP. Si se va a transportar guanidina a la reacción con el material de entrada, recomendamos no exceder los 60 mM en la reacción final y reemplazar el volumen asignado para el clorhidrato de guanidina con agua libre de nucleasas. La guanidina mejora la amplificación isotérmica, lo que produce una detección más rápida del ARN del SARS-CoV-2. El LAMP colorimétrico se realizó utilizando muestras positivas purificadas (10 ng/ul de ARN humano total + ARN sintético de SARS-CoV-2 a 10.000 copias por reacción). Se utilizaron los conjuntos de cebadores E1 o N2 del kit de ensayo LAMP colorimétrico rápido SARS-CoV-2 según lo indicado, y la amplificación se monitorizó en tiempo real utilizando un colorante fluorescente. Para ambos conjuntos de cebadores, la adición de clorhidrato de guanidina a una concentración final de 40-60 mM mejoró la amplificación, lo que resultó en una detección más temprana y un cambio de color mejorado. P: ¿NEB tiene una mezcla maestra para reacciones LAMP o RT-LAMP? R: Sí. Ofrecemos varias opciones para respaldar los protocolos LAMP/RT-LAMP. El kit WarmStart® LAMP (ADN y ARN) (NEB n.° E1700) incluye un colorante fluorescente LAMP 50X para respaldar la detección fluorescente de reacciones LAMP/RT-LAMP. La mezcla maestra colorimétrica WarmStart LAMP 2X (ADN y ARN) (NEB n.° M1800) incluye un indicador colorimétrico basado en pH para la detección visual de reacciones LAMP/RT-LAMP (un cambio de color de rosa a amarillo indica amplificación). Las versiones actualizadas de ambos productos incluyen UDG termolábil y dUTP para reducir el riesgo de contaminación por arrastre (NEB n.° E1708 y NEB n.° M1804, respectivamente). Además, la mezcla maestra multiusos WarmStart LAMP/RT-LAMP 2X (con UDG) (NEB n.° M1708) es compatible con diferentes tipos de entrada de muestra y admite múltiples métodos de detección, incluido el azul de hidroxinaftol. Todas las mezclas maestras LAMP incluyen una combinación de transcriptasa inversa WarmStart RTx y ADN polimerasa Bst 2.0 WarmStart para una amplificación rápida y robusta de dianas de ADN y ARN. Cada mezcla requiere únicamente cebadores LAMP proporcionados por el usuario y muestras de ADN o ARN diana. P: ¿Qué son LAMP y RT-LAMP? R: La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) es un método de amplificación isotérmica diseñado para detectar un ácido nucleico diana sin necesidad de equipos sofisticados. Utiliza una ADN polimerasa con desplazamiento de soporte, como la ADN polimerasa Bst, y de 4 a 6 cebadores que reconocen de 6 a 8 regiones distintas del ADN diana para una reacción de amplificación altamente específica. LAMP ofrece alta sensibilidad (hasta fg o <10 copias de la diana) con resultados rápidos: las reacciones pueden realizarse en tan solo 5-10 minutos. Las reacciones pueden realizarse con recursos limitados, utilizando un baño de agua para la incubación y la detección visual de los resultados, o con medición en tiempo real e instrumentos de alto rendimiento. La detección de dianas de ARN se logra simplemente añadiendo una transcriptasa inversa a la reacción LAMP, mientras que la RT-LAMP se realiza como un flujo de trabajo isotérmico de un solo paso. La transcriptasa inversa WarmStart RTx (NEB n.° M0380) es una ADN polimerasa dirigida por ARN, acoplada a un aptámero de unión reversible que inhibe la actividad RTx por debajo de 40 °C, lo que la hace especialmente adecuada para RT-LAMP. Para obtener más información y ver nuestra oferta de productos LAMP, visite la página de descripción general de aplicaciones LAMP. P: ¿Qué tipo de purificación se recomienda para los cebadores LAMP? R: Al cribar varios conjuntos de cebadores LAMP para identificar los que ofrecen un rendimiento óptimo para una diana determinada, la desalinización estándar suele ser suficiente. Sin embargo, recomendamos la purificación por PAGE o HPLC de los cebadores FIP y BIP como mínimo para el ensayo final para garantizar la robustez en cuanto al tiempo de detección y la sensibilidad.