New England Biolabs, M2080S, sistema de operculación de vaccinia

Reactivo de grado GMP también disponible. Categorías relacionadas: Especificación de encapsulado de ARN. Definición de unidad. Una unidad de enzima de encapsulado de vaccinia se define como la cantidad de enzima necesaria para incorporar 10 pmol de (α₃₂P) GTP en un transcrito de 80 nt en 1 hora a 37 °C. Condiciones de reacción Suplemento de tampón de taponamiento 1X con GTP 0,5 mM y S-adenosilmetionina (SAM) 0,1 mM Incubar a 37 °C Tampón de taponamiento 1X Tris-HCl 50 mM KCl 5 mM MgCl2 1 mM DTT 1 mM (pH 8 a 25 °C) Tampón de almacenamiento Tris-HCl 20 mM NaCl 100 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM Glicerol al 50 % 0,1 % (p/v) Triton® X-100 pH 8 a 25 °C Preguntas frecuentes P: ¿Qué es Cap-0 y Cap-1? R: Cap-0 es una N7-metil guanosina conectada al nucleótido 5' a través de un enlace trifosfato 5' a 5', normalmente denominado m7G cap o m7Gppp- en la bibliografía. En la célula, la estructura Cap-0 es esencial para la traducción eficiente del ARNm que porta la caperuza. Una metilación adicional en la posición 2'O del nucleótido iniciador genera Cap-1, o m7GpppNm-, donde Nm denota cualquier nucleótido con una metilación 2'O. Se ha demostrado que Cap-1 es importante para evadir la respuesta inmunitaria innata celular in vivo. P: ¿Puede la enzima de caperuza de vaccinia (NEB n.° M2080) utilizar análogos de caperuza en la reacción de caperuza? R: No. La enzima de caperuza de vaccinia utiliza GTP y SAM para generar una estructura de caperuza en el ARN trifosfato 5', típicamente un transcrito sintético generado mediante transcripción in vitro. Por otro lado, los análogos de capuchón, como GpppG (NEB #S1407), m7GpppG (NEB #S1404), m7GpppA (NEB #S1405S) y el análogo de capuchón anti-reverso (ARCA; NEB #S1411) se utilizan durante la transcripción in vitro, donde el análogo de capuchón se incorpora directamente a la transcripción como el primer nucleótido en el extremo 5'.