New England Biolabs, M2081L, enzima de protección contra faustovirus

Categorías relacionadas Especificación de capping de ARN Definición de unidad Una unidad de enzima de capping de faustovirus se define como la cantidad de enzima necesaria para convertir 75 pmol de un ppp-ARN de 20 meros en ARN Cap-0 en 30 minutos a 37 °C. Condiciones de reacción Suplemento de tampón de capping 1X con 0,5 mM de GTP y 0,1 mM de S-adenosilmetionina (SAM) Incubar a 37 °C Tampón de capping 1X 50 mM de Tris-HCl 5 mM de KCl 1 mM de MgCl2 1 mM de DTT (pH 8 a 25 °C) Inactivación por calor 70 °C durante 10 minutos Se recomienda la adición de EDTA a 5 mM para evitar la hidrólisis del ARN. Preguntas frecuentes P: ¿Qué son Cap-0 y Cap-1? R: Cap-0, comúnmente conocido como m7G cap o m7GpppN (donde N significa cualquier ribonucleótido), es una N7-metil guanosina conectada por un enlace trifosfato 5' a 5' al extremo 5' de un transcrito. La iniciación de la traducción dependiente de cap, que es el mecanismo principal de iniciación de la traducción en eucariotas, requiere la estructura cap 0. La 2'-O-metilación en la primera posición después del nucleótido Cap-0 genera Cap-1, que también puede representarse por m7GpppNm-. Se ha demostrado que Cap-1 previene la activación inapropiada de los receptores inmunitarios innatos antivirales por transcripciones endógenas in vivo. P: ¿Puede la enzima capping de faustovirus (NEB #M2081) usar análogos de cap en una reacción de capping? R: No. La enzima capping de faustovirus usa GTP y SAM para generar una estructura cap en el ARN trifosfato 5', típicamente una transcripción sintética generada por transcripción in vitro. Los análogos de capuchón, como GpppG (NEB #S1407), m7GpppG (NEB #S1404), m7GpppA (NEB #S1405S) y el análogo de capuchón antirreverso (ARCA; NEB #S1411), se incorporan directamente al transcrito por una ARN polimerasa como el primer nucleótido en el extremo 5′. P: ¿Puede la enzima de capuchón de Faustovirus (NEB #M2081) utilizar análogos de GTP en una reacción de capuchón? R: Los análogos de GTP modificados en 3′, como 3′-biotina-GTP (NEB #N0760S) y 3′-destiobiotina-GTP (NEB #N0761S), se incorporan débilmente por la enzima de capuchón de Faustovirus. Recomendamos la enzima de capuchón de Vaccinia (NEB #M2080) para este caso de uso. P: ¿Es la enzima de caperuza de faustovirus sensible a la estructura secundaria? R: Sí. Las estructuras secundarias que limitan la accesibilidad del extremo 5′ reducirán el rendimiento de la caperuza. Incubar las reacciones de caperuza a temperaturas más altas o precalentar la muestra antes de añadir la enzima puede ayudar a mejorar la caperuza de sustratos estructurados. En casos graves, puede ser necesario modificar la secuencia del transcrito para reducir la estructura secundaria. P: ¿Es la enzima de caperuza de faustovirus activa a temperaturas distintas de 37 °C? R: La FCE mantiene una actividad de caperuza casi óptima hasta 50 °C. Esta actividad se reduce a temperaturas inferiores a 37 °C, aunque se observa mayor actividad con FCE que con VCE a las mismas concentraciones molares.