New England Biolabs, M2200L, Kit de ligadura rápida™

¿Buscas formulaciones y variantes adicionales de la ADN ligasa T4? Categorías relacionadas ADN ligasas Aplicaciones Clonación Ligación,, Clonación rápida: acelere sus flujos de trabajo de clonación con reactivos de NEB Especificación Materiales necesarios pero no suministrados Agua libre de nucleasas (NEB #B1500) Preguntas frecuentes P: ¿Qué factores pueden causar una ligadura y/o transformación incompleta usando el kit Quick Ligation? R: Las causas más probables son: a. La reacción de Quick Ligation fue inactivada por calor. La inactivación por calor en presencia de PEG, que está contenido en el tampón Quick Ligation, inhibe la transformación. b. La mezcla Quick Ligation no fue purificada antes de la electroporación. El PEG en el tampón Quick Ligation previene la electroporación. Los productos de ligadura pueden purificarse usando una columna de centrifugación disponible comercialmente. c. La Quick Ligation fue incubada durante la noche. El PEG en el tampón Quick Ligation puede causar una disminución en la eficiencia de la transformación con el tiempo. No hay ningún beneficio adicional por dejar que la reacción Quick Ligation dure más de 30 minutos. d. La ligadura o transformación fue inhibida por un alto contenido de sal en la reacción. Limpie el ADN. e. La fosfatasa (CIP, BAP o rSAP) no se inactivó o eliminó por completo después del paso de desfosforilación. Siga el procedimiento recomendado para eliminar la fosfatasa o use fosfatasa antártica (NEB #M0289) o fosfatasa alcalina de camarón (rSAP) (NEB #M0371), que se puede inactivar por completo con calor en 5 minutos a 70 °C. Otros factores incluyen: i. ATP degradado en tampón con más de un año de antigüedad. Agregue nuevo ATP a una concentración de 1 mM. ii. La ligadura produjo solo moléculas lineales porque la concentración de ADN fue demasiado alta. Recomendamos una concentración total de ADN de 1-10 µg/ml. iii. El inserto y el vector no tienen fosfatos. iv. Se agregó demasiada mezcla de ligadura a las células. Recomendamos agregar de 1 a 5 µl a 50 µl de células competentes. v. El inserto tenía más de 10 kb y las condiciones no permitieron la circularización. Reduzca la concentración del inserto. vi. La enzima de restricción no cortó eficientemente. Al cortar cerca del final de un fragmento de PCR, recomendamos dejar al menos 6 pares de bases a cada lado del sitio de restricción. vii. La enzima de restricción no se inactivó por completo. El fenol/ETOH purifica el ADN si la enzima no se puede inactivar por calor. viii. La actividad estrella de la digestión de restricción cortó el vector o el inserto. Verifique el ADN en un gel. Si hay bandas adicionales, reduzca la cantidad de enzima o el tiempo para la digestión de restricción. P: ¿Por qué mi transformación no funciona y qué reacciones de control se deben ejecutar? R: a. Las células no son viables ni competentes. Ejecute los controles que se enumeran a continuación y obtenga nuevas células si es necesario. b. La proteína recombinante no es bien tolerada por E. coli. Intenta hacer una fusión con proteína de unión a maltosa usando el sistema pMAL (NEB #E8000S). Prueba otro sistema de expresión que no involucre E. coli. c. El ADN ligado incluía repeticiones invertidas y en tándem seleccionadas contra E. coli. Elimina la secuencia repetida si es posible. Prueba otro sistema de expresión que no involucre E. coli. Nota: Usa la misma concentración de ADN para cada control, típicamente 0,1-1 ng por transformación. i. Vector sin cortar para comprobar la viabilidad celular y probar la resistencia a los antibióticos del plásmido. Sembrar en medio y medio más antibiótico. ii. Vector cortado y no ligado: para comprobar si hay vector sin cortar, puede ser necesaria la purificación en gel para eliminar el último 0,1% del vector sin cortar. iii. Plásmido cortado y religado (sin inserto) para comprobar la actividad de la ligasa y la integridad del extremo del ADN. Debe ser del 60-70% del valor obtenido para el vector sin cortar. iv. Plásmido cortado, desfosforilado y religado para comprobar el fondo debido al tratamiento incompleto con fosfatasa. Debe ser < 3% del valor obtenido para el vector sin cortar. P: ¿Cuál es la concentración de ADN ligasa T4 incluida en el kit de ligadura rápida? R: 2.000.000 unidades/ml. Es la misma que la de la ADN ligasa T4 de alta concentración de NEB (NEB n.° M0202). P: ¿Se puede usar la ADN ligasa T4 convencional (400.000 unidades/ml) con el tampón de ligadura rápida? R: Al usar la ADN ligasa T4 convencional, aumente el tiempo de reacción a 15 minutos. No se recomiendan incubaciones superiores a 30 minutos. P: ¿Cómo calcular la molaridad de los extremos? R: NEB sugiere usar la herramienta en línea gratuita NEBioCalculator. Esta herramienta calcula la molaridad de los extremos, así como otros cálculos biomatemáticos. Si desea calcular "a mano", tenga en cuenta lo siguiente: Molaridad = [(µg/µl) ÷ (pares de bases x 650 daltons)] x 2 extremos Ejemplo: Calcule la molaridad de los extremos para un vector linealizado de 5 kb que tiene una concentración de 250 ng/µl: [(0,25 µg/µl) ÷ (5000 x 650 daltons)] x 2 = 154 nM Calcule la molaridad de los extremos si pone 50 ng de este vector en una reacción de ligadura de 20 µl: 50 ng ÷ 20 µl = 0,0025 µg/µl [(0,0025 µg/µl) ÷ (5000 x 650)] x 2 = 1,54 nM Determine la cantidad de un Se necesita un inserto de 1 kb para lograr una relación inserto:vector de 3:1: 3 X 1,54 nM = 4,62 nM [(X µg/µl) ÷ (1000 x 650)] x 2 = 4,62 nM 0,0015 µg/µl x 20 µl = 0,03 µg = 30 ng ¿Esta reacción se encuentra dentro del rango óptimo de 1–10 µg/ml? (50 ng de vector + 30 ng de inserto) ÷ 20 µl = 4 µg/ml P: El protocolo del Quick Ligation Kit indica que la reacción no debe inactivarse por calor. ¿Cómo puedo inactivar la actividad de ligación? R: Normalmente no es necesario inactivar las reacciones de ligación rápida. La reacción puede utilizarse directamente para la transformación con células químicamente competentes, o bien, el ADN puede purificarse mediante precipitación con etanol, purificación en gel o cualquier columna o microesfera de purificación de ADN adecuada para separar el producto de la ligadura de la actividad enzimática y otros componentes de la reacción. Si desea detener la reacción sin purificación, puede añadir un volumen igual de 50 mM de EDTA y mezclar mediante pipeta. Sin embargo, esto interferirá con las reacciones posteriores que requieren magnesio u otros cationes divalentes.