New England Biolabs, M2622L, ligasa de ADN Hi-T4™

¿Busca formulaciones y variantes adicionales de la ADN ligasa T4? Categorías relacionadas: ADN ligasas, aplicaciones: BioBrick®, ensamblaje, clonación, especificación de ligadura, definición de unidad. Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para obtener una ligadura del 50 % de 6 µg de ADN Lambda-HindIII en 30 minutos a 25 °C en un volumen total de reacción de 20 µl. Condiciones de reacción 1X T4 ADN ligasa tampón de reacción Incubar a 25 °C 1X T4 ADN ligasa tampón de reacción 50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 1 mM ATP 10 mM DTT (pH 7,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 10 mM Tris-HCl 50 mM KCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 50% glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 10 minutos Preguntas frecuentes P: ¿Cuáles son algunas de las causas del fallo de la reacción de ligadura que pueden provocar un fallo de la transformación? R: La ligadura falló porque no había ATP o Mg2+. Utilice el tampón suministrado o añada ATP a un tampón compatible. El ATP en tampones de más de un año puede haberse degradado lo suficiente como para causar problemas. Al complementar con ATP, asegúrese de utilizar riboATP, ya que el desoxirriboATP no funcionará. La ligadura falló debido a la presencia de EDTA en la reacción. Limpie el ADN (recomendamos los kits de purificación de ácidos nucleicos Monarch®). CIP, BAP, fosfatasa antártica o SAP no se inactivan por completo tras el paso de desfosforilación. Siga el procedimiento recomendado para eliminar la fosfatasa. La concentración fue demasiado alta, lo que provocó que la ligadura solo produjera ADN lineal. Mantenga la concentración total de ADN entre 1 y 10 μg/ml. El inserto y el plásmido no contienen fosfatos. Nota: es posible que los cebadores no contengan fosfatos, lo que impide la ligadura de extremos romos con vectores tratados con CIP. Solicite cebadores con fosfatos o fosforile los cebadores con polinucleótido quinasa T4 antes de usarlos. Se añadió demasiada mezcla de ligadura a las células. Añada entre 1 y 5 μl a 50 μl de células competentes. El inserto era grande y las condiciones no permitían la circularización. Reduzca la concentración del inserto. La ligasa estaba inactiva. Pruebe con ADN Lambda HindIII u otro sustrato adecuado. La mezcla de ligadura contenía PEG y se incubó durante la noche. La ligadura prolongada con PEG disminuye la eficiencia de la transformación. Esto podría deberse a la producción gradual de grandes fragmentos lineales de ADN que pueden inhibir la transformación. El tampón de ligasa de ADN StickTogether™ contiene PEG. La mezcla de ligadura no se purificó antes de la electroporación. Debe eliminarse el tampón o la sal generará una chispa. Dialice la muestra o utilice una columna de centrifugación para purificarla (recomendamos los kits de purificación de ácidos nucleicos Monarch). El PEG del tampón de ligasa de ADN StickTogether™ previene la chispa, pero también la electroporación. El PEG debe eliminarse mediante una columna de centrifugación. P: ¿Cuándo se debe elegir la enzima Hi-T4 ADN ligasa? R: Mientras que la T4 ADN ligasa se inactiva de forma constante a temperaturas >37 °C, la Hi-T4 ADN ligasa puede soportar temperaturas de hasta 45 °C durante períodos prolongados (hasta 72 horas) sin una pérdida significativa de actividad. Por lo tanto, la Hi-T4 DNA Ligasa debe ser la enzima de elección si la reacción de ligación se va a llevar a cabo a una temperatura más alta (>37 °C) durante un período de tiempo prolongado (>15 minutos). P: ¿Qué tampón debo usar con la Hi-T4 DNA Ligasa? R: Si se intenta ligar extremos cohesivos, recomendamos usar la Hi-T4 DNA Ligasa en tampón 1X T4 DNA Ligasa. Si se intenta ligar extremos romos o salientes de una sola base, se debe usar la Hi-T4 DNA Ligasa en nuestro tampón StickTogether™ DNA Ligasa que contiene PEG. No detenga la reacción con calor, ya que el tratamiento térmico del PEG en el tampón StickTogether™ DNA Ligasa inhibirá la transformación. P: ¿Cuál es la actividad de la Hi-T4 DNA Ligasa en otros tampones? R: La Hi-T4 DNA Ligasa es 100 % activa en el tampón T4 DNA Ligasa. Al igual que la ADN ligasa T4, la ADN ligasa Hi-T4 presenta una actividad reducida en los tampones NEBuffer 3/r3.1 y HiFi Taq ADN ligasa debido a su alto contenido en sal. Tampón % Actividad1 Tampón de ADN ligasa T4 100 % Tampón NE r1.12 100 % Tampón NE r2.12 100 % Tampón NE r3.12 50 % Tampón rCutSmart® 2 100 % Tampón de ADN ligasa Taq 2 100 % Tampón de ADN ligasa HiFi Taq 2 50 % 1 Actividad relativa a la actividad en un sustrato de extremo cohesivo en tampón de ADN ligasa T4 (25 °C durante 10 minutos). 2 Suplementado con 1 mM de ATP. Asegúrese de usar riboATP (NEB n.º P0756), ya que el desoxirriboATP no funcionará. Para ver su % de actividad funcional en CutSmart y la de otras enzimas modificadoras de ADN en el flujo de trabajo de clonación, consulte la tabla "Actividad de enzimas modificadoras de ADN en el tampón CutSmart®". P: ¿Se puede inactivar esta ligasa por calor? R: Sí, al igual que la ADN ligasa T4, esta ligasa se puede inactivar por calor durante 10 minutos a 65 °C. No la inactive por calor si hay PEG en el tampón de reacción (tampón de ADN ligasa StickTogether™), ya que se inhibirá la transformación. P: ¿Cuál es la diferencia entre las definiciones de unidad de la ADN ligasa T4 (NEB n.° M0202) y la ADN ligasa Hi-T4 (NEB n.° M2622)? R: Tanto la ADN ligasa T4 como la ADN ligasa Hi-T4 se definen como una ligadura del 50 % de 6 μg de fragmentos HindIII; sin embargo, la temperatura de incubación difiere. La unidad de ADN ligasa T4 se determina a 16 °C, mientras que la unidad de ADN ligasa Hi-T4 se determina a 25 °C. P: ¿Cuánto ADN se debe usar en una ligadura con esta ligasa? R: La unidad utiliza 6 μg del fragmento HindIII. Esta alta concentración de ADN se puede usar para la ligadura del enlazador. Para promover la formación de círculos, útil en la transformación, se debe usar una concentración total de ADN menor. La concentración total de vector + inserto debe estar entre 1 y 10 μg/ml para una ligadura eficiente. Se recomiendan proporciones molares vector:inserto entre 1:1 y 1:10 (1:3 es lo típico). Si no está seguro de sus concentraciones de ADN, realice múltiples ligaduras con proporciones variables.