New England Biolabs, M3003E, Luna® Universal qPCR Master Mix

Categorías relacionadas Luna® qPCR y RT-qPCR,, PCR, qPCR y tecnologías de amplificación Aplicaciones qPCR y RT-qPCR basadas en colorantes,, qPCR y RT-qPCR,, RT-qPCR de dos pasos, Preguntas frecuentes P: ¿Cómo uso la qPCR para determinar la concentración de mi material? R: La PCR cuantitativa (qPCR) utiliza fluorescencia en tiempo real para medir la cantidad de ADN presente en cada ciclo durante una PCR. Se han desarrollado una amplia variedad de enfoques para generar una señal fluorescente, los más comunes de los cuales utilizan sondas de hidrólisis (p. ej., TaqMan®) o un colorante de unión al ADN de doble cadena (p. ej., SYBR® Green). En un punto en el que la señal de fluorescencia de la qPCR es detectable sobre la fluorescencia de fondo, se puede determinar un ciclo de cuantificación o valor Cq. Los valores Cq se pueden utilizar para evaluar la abundancia relativa del objetivo entre dos o más muestras. Alternativamente, se pueden usar para calcular cantidades absolutas de la diana con referencia a una curva estándar apropiada, derivada de una serie de diluciones de ADN conocidas. Normalmente, el software del instrumento de qPCR realizará los gráficos y cálculos necesarios para las determinaciones de concentración. Como alternativa, las herramientas en línea de NEB incluyen una calculadora de qPCR, disponible en NEBiocalculator.neb.com. P: ¿Puedo configurar mi Luna® qPCR a temperatura ambiente? R: Sí. Luna qPCR se puede configurar a temperatura ambiente, pero para obtener mejores resultados, las reacciones deben mantenerse en hielo antes del termociclado. La ADN polimerasa presente en la mezcla maestra de qPCR, la Hot Start Taq DNA Polymerase de NEB (NEB #M0495), contiene un aptámero modificado único (SOMAmer®) para el control de la actividad dependiente de la temperatura y se inhibe por debajo de 45 °C. Esta inhibición reversible previene la actividad inespecífica no deseada hasta que la reacción se calienta por encima de la temperatura de liberación durante el paso de desnaturalización inicial del ciclado de PCR. P: ¿Cuál es la diferencia entre las versiones con sonda y con colorante de las mezclas Luna® qPCR? R: La qPCR se mide típicamente de dos maneras: mediante un colorante intercalante que fluoresce con mayor intensidad al unirse al ADN bicatenario, o mediante un oligonucleótido "sonda" marcado con fluorescencia que se anela a una secuencia específica en el amplicón de PCR. La fluorescencia de fondo de la sonda se previene mediante la presencia de un grupo extintor. En el caso de las sondas de hidrólisis, el extintor se separa del fluoróforo durante la amplificación por la actividad nucleasa 5'→3' de la Taq ADN polimerasa. Para permitir la detección con colorante, la mezcla Luna Universal qPCR contiene un colorante intercalante que se detecta en el canal SYBR® Green o FAM de la mayoría de los instrumentos de tiempo real. Los productos Luna Universal Probe qPCR no contienen este colorante de unión al ADN bicatenario (ya que interferiría con el uso de sondas marcadas con FAM). Los usuarios deben complementar la mezcla con un oligonucleótido sonda marcado, además de los cebadores de PCR directa e inversa. Tenga en cuenta que el colorante de referencia pasivo presente en ambas mezclas no interfiere con el uso de sondas marcadas con ROX. P: ¿Debería utilizar detección basada en sonda o en colorante para mis ensayos de qPCR? R: La detección basada en colorante (p. ej., SYBR® Green) solo requiere la adición de cebadores de PCR, lo que la convierte en una opción de qPCR rentable. Sin embargo, el colorante intercalante detectará cualquier dsADN producido en la reacción. Por lo tanto, se puede observar una amplificación fuera de objetivo y sin molde (NTC) para algunos conjuntos de cebadores, lo que resulta en una cuantificación imprecisa. Las curvas de desnaturalización (fusión) realizadas después de la PCR se pueden utilizar para distinguir entre productos correctos e inespecíficos. Además, solo se puede medir un único amplicón en una qPCR basada en colorante, sin capacidad para realizar reacciones multiplex. La detección basada en sonda requiere el diseño y la obtención de un oligonucleótido sonda marcado con fluorescencia y específico de la secuencia, además de los cebadores de PCR habituales. Esto aumenta los costos del ensayo, pero los experimentos de qPCR basados ​​en sondas se benefician de una especificidad extrema y es poco probable que resulten en una cuantificación inexacta debido a la amplificación de NTC. Las reacciones multiplex son posibles con sondas, ya que se pueden diseñar diferentes amplicones con fluoróforos únicos de acuerdo con las capacidades ópticas del instrumento de qPCR. P: ¿Cómo debo diseñar cebadores para Luna® qPCR? R: Recomendamos usar software de diseño de cebadores (p. ej., Primer3) para seleccionar las secuencias diana y de cebador con el fin de maximizar la eficiencia de la amplificación y minimizar la amplificación no específica y los dímeros de cebador. Luna qPCR también es compatible con los ensayos de qPCR disponibles comercialmente. Si diseña cebadores manualmente, le recomendamos diseñar amplicones cortos (70 pb a 200 pb) con contenido de GC equilibrado (40-60%). Apunte a una Tm de aproximadamente 60 °C utilizando la configuración de Hot Start Taq en la calculadora de Tm de NEB (TmCalculator.neb.com). Para dianas de ADNc y ARN, se recomienda diseñar cebadores en sitios de empalme conocidos (uniones exón-exón) para evitar la amplificación a partir del ADN genómico. P: ¿Qué longitud debe tener mi amplicón para qPCR? R: Un factor importante en un experimento de qPCR es maximizar la eficiencia de la amplificación por PCR, y los amplicones de PCR cortos ayudan a garantizar una alta eficiencia. Los amplicones típicos de qPCR tienen una longitud de 70-200 pb, y recomendamos diseñar su diana en ese rango. Se pueden usar amplicones más largos, pero pueden requerir optimización (p. ej., mayores tiempos de extensión). P: ¿Por qué Luna® qPCR Mix es azul? ¿Este colorante interferirá con la detección? R: Luna qPCR Mix contiene un colorante de referencia visual inerte que le da a la mezcla un color azul claro. Esta apariencia coloreada facilita la identificación de los pocillos de una placa de qPCR que se han cargado con reactivos, lo que puede ser difícil debido al pequeño tamaño de los pocillos y la naturaleza opaca de muchas placas de qPCR de 96 y 384 pocillos. El colorante azul se ha evaluado ampliamente en PCR y qPCR, y no inhibe ni interfiere con la detección de qPCR. P: ¿Puedo ejecutar la mezcla Luna® qPCR en mi instrumento de qPCR? R: Las siguientes mezclas Luna qPCR contienen un colorante de referencia pasivo universal que permite la compatibilidad con una amplia variedad de instrumentos en tiempo real, incluidos los que no utilizan colorante de normalización de referencia pasivo (p. ej., Bio-Rad® CFX), una referencia pasiva de baja concentración (p. ej., Applied Biosystems® 7500 o QuantStudio®) o una referencia pasiva de alta concentración (p. ej., Applied Biosystems 7900 o StepOne®). Luna Universal qPCR Master Mix (NEB #M3003) Luna Universal Probe qPCR Master Mix (NEB #M3004) Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit (NEB #E3005) Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit (NEB #E3006) Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix con UDG (NEB #M3019) LyoPrime Luna Probe One-Step RT-qPCR Mix con UDG (NEB #L4001) El Luna Probe One-Step RT-qPCR Kit (sin ROX) (NEB #E3007) y Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix con UDG (sin ROX) (NEB #M3029) carecen de un colorante de referencia y se pueden usar con cualquier instrumento que no requiera normalización ROX. Consulte las instrucciones del fabricante del instrumento para obtener más detalles. Además, Luna Mix se puede usar con condiciones de ciclado estándar o rápido. P: ¿Puedo usar configuraciones rápidas del instrumento con Luna® qPCR Mix? R: Luna qPCR Mix es compatible con velocidades de rampa rápidas y estándar en instrumentos que ofrecen ambas. Recomendamos temperaturas y tiempos de ciclado específicos (consulte el protocolo o el manual para obtener más información), pero cualquiera de las configuraciones de rampa se puede usar con estas condiciones de ciclado. (Nota: las condiciones de ciclado deben verificarse después de cambiar la configuración de la velocidad de rampa; en ciertos instrumentos de tiempo real, cambiar la velocidad de rampa también revertirá las condiciones de ciclado a la configuración predeterminada del instrumento). P: ¿Necesito agregar ROX? R: Algunos instrumentos de tiempo real recomiendan el uso de un colorante de referencia pasivo (normalmente ROX) para compensar las variaciones entre pocillos que podrían deberse a limitaciones de la máquina, como el "efecto de borde", burbujas, pequeñas diferencias de volumen y autofluorescencia del polvo o partículas en la reacción. Sin embargo, la normalización de ROX tiene poco efecto sobre las variaciones causadas por errores de pipeteo de plantillas/cebadores, mezcla heterogénea y problemas de evaporación/condensación. Los siguientes productos Luna® qPCR contienen un colorante de referencia pasivo universal que permite la compatibilidad con una variedad de instrumentos en tiempo real, incluidos aquellos que no utilizan normalización de referencia pasiva y aquellos que utilizan una cantidad baja o alta de colorante de referencia pasivo (ROX). Luna Universal qPCR Master Mix (NEB #M3003) Luna Universal Probe qPCR Master Mix (NEB #M3004) Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit (NEB #E3005) Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit (NEB #E3006) Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix con UDG (NEB #M3019) LyoPrime Luna Probe One-Step RT-qPCR Mix con UDG (NEB #L4001) El Luna Probe One-Step RT-qPCR Kit (sin ROX) (NEB #E3007) y Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix con UDG (sin ROX) (NEB #M3029) carecen de un colorante de referencia y se pueden usar con cualquier instrumento que no requiera normalización ROX. Consulte las instrucciones del fabricante del instrumento para obtener más detalles. Instrumento qPCR ROX Bio-Rad® iQ™5, CFX96, CFX384, Opticon Roche Lightcycler® Qiagen Rotor-Gene™ Eppendorf Mastercycler® Cepheid® SmartCycler® No recomendado/obligatorio Applied Biosystems® 7500, 7500 Fast, QuantStudio™, ViiA7™ Agilent Mx™ ROX baja (~50 nM final) Applied Biosystems® 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900HT Fast, StepOne™, StepOnePlus™ ROX alta (~500 nM final) P: ¿Cuántas diluciones debo usar para hacer una curva estándar? R: Los experimentos típicos de qPCR incluyen estándares que abarcan 5 órdenes de magnitud (cinco diluciones seriadas de 10 veces) para generar una curva estándar. Seleccione la cantidad mínima de estándar que represente aproximadamente una copia del objetivo cuando se desee la máxima sensibilidad. El número de puntos en la curva estándar se puede aumentar o disminuir según se desee, y se pueden usar tan solo tres puntos cuando el objetivo, el ensayo y la muestra están bien caracterizados. P: ¿Por qué NEB recomienda 40-45 ciclos? R: Una amplificación de 40 ciclos es suficiente para objetivos con un alto número de copias o cuando se utiliza un ensayo bien caracterizado donde la amplificación sin molde no es un problema. Sugerimos 45 ciclos para maximizar la confianza en la detección de objetivos con un bajo número de copias o con una sola copia. Ciclos adicionales también pueden ayudar a detectar la amplificación no específica para un conjunto de cebadores determinado al utilizar mezclas de qPCR basadas en colorantes. P: ¿Contiene dUTP la mezcla Luna® qPCR? ¿Puedo utilizar métodos de prevención de contaminación por arrastre? R: Sí, la mezcla Luna qPCR está formulada con una mezcla de dTTP y dUTP. Esto garantiza tanto una amplificación por PCR eficiente como la incorporación de dU en los productos durante la qPCR. Los productos de qPCR que contienen dU sirven como sustrato para la uracilo ADN glicosilasa, lo que permite la prevención de la contaminación por arrastre. Si un amplicón está destinado a un uso rutinario, si se abrirán los recipientes de qPCR o si se desea evitar la contaminación por arrastre, se pueden agregar 0,025 unidades/μL de UDG termolábil antártico (NEB #M0372) a la mezcla de reacción. Cuando se incluye UDG termolábil antártico, configure los experimentos de qPCR a temperatura ambiente o incluya un paso de incubación adicional de 2 minutos a 25 °C antes de las condiciones de ciclado predeterminadas. P: ¿Por qué tengo múltiples picos en mi curva de fusión? R: Una curva de desnaturalización (fusión) típica realizada después del ciclado de qPCR con un colorante intercalante, generalmente dará lugar a un solo pico distintivo en el gráfico de la derivada negativa de la fluorescencia frente a la temperatura. Esto indica que los productos de ADN bicatenario amplificados son una sola especie discreta. La presencia de múltiples especies de ADN en la misma reacción puede generar múltiples picos en la curva de fusión, lo que suele indicar la presencia de productos de amplificación contaminantes o no deseados. Compare los cebadores de PCR con la secuencia de ADN de entrada para determinar si se puede amplificar un producto distinto del objetivo deseado, por ejemplo, debido a la similitud de secuencias o a la presencia de múltiples formas de la misma secuencia génica. Rediseñe los cebadores si es necesario. En ocasiones, debido a las características específicas de la secuencia o al contenido de GC, ciertos productos de qPCR experimentarán transiciones de fusión en varias etapas, lo que dará lugar a una curva de fusión con múltiples picos. Este tipo de productos se puede considerar una qPCR exitosa. El perfil de fusión de cualquier secuencia de interés se puede predecir con la herramienta en línea uMelt. P: ¿Cómo puedo distinguir la amplificación sin molde (NTC) de los productos reales? R: La forma más sencilla de determinar si se está produciendo una amplificación sin molde y si esto afecta a la cuantificación precisa es incluir reacciones de control que contengan los cebadores de interés, pero excluyan el objetivo de entrada (añadiendo únicamente tampón de muestra o agua en su lugar). Estas reacciones de control sin molde (NTC) pueden producir productos de amplificación, que generalmente tendrán un tamaño o contenido de secuencia diferente al del producto de ADN deseado y, por lo tanto, se desnaturalizarán con un perfil de fusión distinto. Comparar las curvas de fusión de las diferentes reacciones puede permitir la detección de cualquier amplificación sin molde. Cualquier reacción que muestre un perfil de fusión similar al NTC debe eliminarse de la curva estándar y de los cálculos de cuantificación. P: ¿Por qué veo curvas de amplificación en mis muestras de NTC? R: Los productos pueden aparecer en pocillos de control sin molde (NTC) debido a la capacidad de algunas secuencias de cebadores para formar estructuras que las ADN polimerasas pueden usar como sustratos. La versión más común de este problema es el "dímero de cebadores", en el que pequeñas regiones de complementariedad en los dos cebadores de qPCR permiten la producción de una estructura amplificable. Muchas herramientas de diseño de cebadores buscan eliminar esta posibilidad y garantizar que ningún cebador pueda formar una estructura secundaria dentro de su propia secuencia. Este tipo de amplificación se puede discernir mediante la evaluación de los perfiles de la curva de fusión, ya que un dímero de cebador o una amplificación de tipo inespecífico darán como resultado productos de ADN con un pico de fusión diferente al del producto de qPCR correcto. Una segunda explicación para la amplificación en pocillos de NTC es la presencia de productos de PCR contaminantes amplificados en experimentos de qPCR anteriores. Esto es una preocupación importante cuando el mismo ensayo se utiliza repetidamente, y en particular cuando los recipientes de reacción se abren después de que se complete la qPCR. Los procedimientos generales de esterilización pueden evitar este problema, como no abrir los recipientes después de las reacciones o hacerlo en un área de laboratorio satélite con equipo separado y la descontaminación rutinaria del espacio y el equipo del laboratorio. Las curvas de fusión se pueden utilizar para determinar si la amplificación de NTC es causada por contaminación por arrastre. Si este es el caso, los productos en las reacciones de NTC serán de la misma especie que el objetivo previsto y los perfiles de fusión coincidirán en consecuencia. Si se detecta contaminación, se deben reemplazar todos los reactivos (cebadores, agua, mezcla para qPCR), descontaminar el equipo con una solución de lejía al 10 % y utilizar procedimientos estériles para experimentos futuros. El uso de 0,2 U/μL de UDG Termolábil Antártico (NEB n.° M0372) puede ayudar a mitigar la contaminación por arrastre en situaciones donde sea un problema persistente o en aplicaciones especialmente sensibles. P: ¿Qué muestras se pueden utilizar en qPCR con la mezcla Luna®? R: Para obtener los mejores resultados, recomendamos la extracción o purificación del material de partida de ADN/ARN. Las mezclas maestras para qPCR Luna funcionan con ácidos nucleicos de diversos tipos de muestras purificados mediante métodos típicos basados ​​en columnas. (p. ej., Monarch® Genomic DNA Purification Kit (NEB n.° T3010). Si bien las mezclas maestras Luna qPCR son compatibles con una variedad de kits de ADNc de uso común, recomendamos usar el kit LunaScript® RT SuperMix (NEB n.° E3010) antes de la mezcla maestra Luna qPCR para flujos de trabajo RT-qPCR de dos pasos. No es necesario purificar el ADNc antes de usarlo en Luna qPCR, pero debe diluirse al menos 1:10 en la reacción de qPCR. P: ¿Puedo usar ADNc? ¿Importa cómo lo prepare? R: La mezcla maestra Luna® qPCR funciona extremadamente bien con el ADNc preparado utilizando kits de síntesis de ADNc disponibles comercialmente. Si bien Luna qPCR es compatible con una variedad de kits de ADNc de uso común, recomendamos usar el kit de síntesis de primera cadena Protoscript® II (NEB n.° E6560). No es necesario purificar el ADNc antes de usarlo en Luna qPCR, pero debe diluirse al menos 1:10 en la reacción de qPCR. Reacción de qPCR. P: ¿Cuánto material molde puedo usar en Luna® qPCR? R: Generalmente, una concentración útil de material estándar y desconocido estará en el rango de 106-1 copias, y la cantidad de ADN de entrada correspondiente varía según el tamaño del genoma. Para genomas grandes (p. ej., ADN genómico humano), recomendamos usar entre 50 ng y 10 pg de ADN. P: ¿Cuánto cebador debo usar para la mezcla maestra universal para qPCR Luna®? R: Para la mayoría de los objetivos, una concentración final de 250 nM para cada cebador proporcionará un rendimiento óptimo. Si es necesario, la concentración final del cebador se puede optimizar entre 100 y 500 nM. P: ¿Puedo usar tiempos de ciclado más cortos? R: Sí. Para muchos objetivos, se pueden usar tiempos de incubación más cortos en cada paso. Sin embargo, se recomiendan condiciones de ciclado estándar como punto de partida, y pueden ser necesarias para ensayos complejos, como aquellos con bajo aporte de ADN. P: ¿Cuál es el colorante fluorescente de unión al ADN bicatenario presente en la mezcla maestra para qPCR Luna®? R: El colorante presente en Luna La mezcla maestra para qPCR es un colorante intercalante fluorescente con propiedades de excitación y emisión similares a las de SYBR®. El colorante presenta una emisión máxima de ~535 nm cuando se une a ADN bicatenario (círculos verdes), pero presenta una fluorescencia débil en presencia de ADN monocatenario o en ausencia de ADN (triángulos naranjas). Para habilitar la detección con colorante, seleccione el canal SYBR Green o FAM en la mayoría de los instrumentos en tiempo real.