Laboratorios de biotecnología de Nueva Inglaterra, M3010L, LunaScript® RT SuperMix

Versión solo Supermix; este producto no incluye una mezcla de control No-RT ni agua libre de nucleasas. Categorías relacionadas Luna® qPCR y RT-qPCR,, Síntesis de ADNc y transcriptasas inversas Aplicaciones qPCR y RT-qPCR,, RT-qPCR de dos pasos,, Transcripción inversa (síntesis de ADNc), Preguntas frecuentes P: ¿Puedo usar muestras de ARN purificadas de diferentes condiciones de almacenamiento, como RNALater, en mis reacciones de síntesis de ADNc LunaScript®? R: En general, las muestras de ARN purificadas de diferentes fuentes funcionan bien con los productos LunaScript. Normalmente recomendamos la purificación de ARN mediante métodos basados ​​en columnas (p. ej., Monarch® RNA Miniprep Kit (NEB #T2010S)). P: ¿Puedo agregar cebadores específicos de genes en mi reacción de síntesis de ADNc LunaScript®? R: LunaScript RT SuperMix está optimizado para la detección por RT-qPCR de 2 pasos y contiene todo lo necesario para la síntesis de ADNc, incluido el cebador dT y el hexámero aleatorio. Si se desean cebadores alternativos o específicos de genes para la síntesis de ADNc, el kit LunaScript RT Master Mix (sin cebadores) es más adecuado. LunaScript RT Master Mix (sin cebadores) (NEB n.° 3025) es idéntico al LunaScript RT SuperMix, pero sin cebadores. P: ¿Puedo preparar mi reacción de síntesis de ADNc a temperatura ambiente con LunaScript® RT SuperMix? R: Sí. Las reacciones de síntesis de ADNc de LunaScript se pueden preparar a temperatura ambiente. P: ¿Puedo usar un tiempo de incubación más corto para mi reacción de síntesis de ADNc con LunaScript® RT SuperMix? R: Sí. Para muchas dianas, se pueden usar tiempos de incubación de tan solo 2 minutos para el paso de síntesis de ADNc a 55 °C. Sin embargo, se recomiendan condiciones de ciclado estándar como punto de partida, y pueden ser necesarias para ensayos complejos o con muestras de ARN que contengan impurezas. P: ¿Puedo usar los productos de ADNc de LunaScript® directamente en la qPCR? ¿Cuánto puedo usar para la detección en una reacción de qPCR? R: El producto de ADNc se puede usar directamente en la reacción de qPCR. En general, recomendamos 1 μl de producto de ADNc en una detección de qPCR de 20 μl. Cuando sea útil, hasta el 20 % del volumen de qPCR puede ser producto de ADNc sin diluir (p. ej., 4 μl de producto de ADNc en una reacción de qPCR de 20 μl). P: ¿Cuánta plantilla de ARN debo usar en mis reacciones de síntesis de ADNc de LunaScript®? R: Las mezclas de LunaScript funcionan bien con plantillas de ARN purificadas, incluidas muestras de ARN total, ARNm y transcripciones in vitro. Cantidad en la reacción de 20 μl ARN total ≤ 1 μg Poli(A)-ARN ≤ 1 μg Transcripciones in vitro 100 ng P: ¿Cómo debo almacenar los productos de ADNc de LunaScript®? R: El producto de ADNc se puede almacenar a 4 °C para su uso a corto plazo. Para el almacenamiento a largo plazo, debe almacenarse a -20 °C o -80 °C. P: ¿Cómo debo elegir entre un enfoque de RT-qPCR de un paso o RT-qPCR de dos pasos? R: Hay dos métodos disponibles para cuantificar muestras de ARN: RT-qPCR de un paso y de dos pasos. En ambos casos, el ARN primero se transcribe de manera inversa en ADNc, que luego se utiliza como plantilla para la amplificación por qPCR. La transcripción inversa se puede realizar por separado de la qPCR (es decir, RT-qPCR de dos pasos) o directamente en la mezcla de qPCR (es decir, RT-qPCR de un paso). Los flujos de trabajo de un paso se prefieren comúnmente en ensayos de diagnóstico molecular, donde las entradas de muestras pueden ser limitantes o se examinan numerosas muestras. Se prefiere la RT-qPCR de dos pasos cuando se realizarán múltiples interrogaciones del mismo material de partida o donde puede requerirse el archivo de ADNc. Para obtener más detalles, consulte "Elección de RT-qPCR de un paso o RT-qPCR de dos pasos". P: ¿Debo incluir una reacción de control sin transcriptasa inversa (RT) al configurar mi reacción de síntesis de ADNc? R: Sí. Cuando está presente, el ADN genómico o los productos de arrastre pueden interferir con la cuantificación precisa del ARN, especialmente en dianas con un bajo número de copias. Por lo tanto, es importante realizar las reacciones de control sin RT adecuadas para tener en cuenta estos efectos. Además, se deben configurar reacciones de control sin plantilla (NTC) para demostrar que las reacciones positivas son significativas. Consulte el kit LunaScript RT SuperMix (NEB n.° E3010) si necesita una mezcla de control sin RT. P: ¿Qué reactivos de qPCR recomiendan para la detección de productos de ADNc? R: Los productos de ADNc generados con las mezclas LunaScript® se han evaluado ampliamente en qPCR utilizando la mezcla maestra Luna® Universal qPCR (NEB n.° M3003) y la mezcla maestra Luna Universal Probe qPCR (NEB n.° M3004). En combinación, estos productos proporcionan un flujo de trabajo RT-qPCR de dos pasos con excelente sensibilidad y cuantificación lineal y precisa. Además, LunaScript es compatible con otras importantes mezclas comerciales de qPCR. P: ¿Qué temperatura debo usar para mi reacción de síntesis de ADNc LunaScript®? R: La transcriptasa inversa termoestable Luna® permite una síntesis eficiente de ADNc a temperaturas elevadas en comparación con la RT MMLV. Para la mayoría de las dianas, la síntesis de ADNc se puede lograr con una incubación de 10 minutos a 55 °C. Para moldes difíciles, la temperatura de síntesis de ADNc se puede aumentar hasta 65 °C. P: ¿Por qué tengo bajos rendimientos de ADNc? R: Hay varias causas para un bajo rendimiento de ADNc. Aquí hay algunas sugerencias para mejorar el rendimiento: Compruebe la integridad del ARN mediante electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante o BioAnalyzer (Agilent). El ARN intacto de alta pureza es esencial para la síntesis completa de ADNc. El ARN debe tener una relación mínima A260/A280 de 1,7 o un número RIN superior a 8. La precipitación con etanol seguida de un lavado con etanol al 70 % puede eliminar contaminantes como el EDTA y el guanidinio. La precipitación con cloruro de litio puede eliminar polisacáridos. Un paso de purificación de ARN mediante kits de extracción de ARN o extracción con fenol/cloroformo puede eliminar proteínas contaminantes como las proteasas. Aumente la cantidad de ARN utilizada, especialmente para ARN poco abundante. P: ¿El colorante azul del LunaScript® RT SuperMix interferirá con la detección? R: Los productos LunaScript contienen un colorante de referencia visual inerte que le da a la mezcla un color azul claro. Esta apariencia coloreada facilita el seguimiento de la configuración de la reacción al identificar la presencia frente a la ausencia y las diferencias de volumen de las reacciones de ADNc dentro de los tubos, las puntas de pipeta y las reacciones de qPCR posteriores. El colorante azul se ha evaluado ampliamente en la síntesis de ADNc y en experimentos de qPCR y no se ha observado que inhiba ni interfiera con la detección de ARN. P: ¿Cómo elijo entre los kits de síntesis de ADNc de primera cadena de NEB? R: La Tabla 1 destaca las principales ventajas y aplicaciones de los kits de síntesis de ADNc de primera cadena de NEB. Kits de síntesis de ADNc Kit LunaScript® RT SuperMix (NEB n.° E3010) Kit LunaScript RT Master Mix (sin cebadores) (NEB n.° E3025) Kit de síntesis de ADNc de primera cadena ProtoScript® II (NEB n.° E6560) Componentes LunaScript RT SuperMix (5X)* Mezcla de control sin RT (5X)* Agua sin nucleasas *Ambas mezclas contienen hexámero y d(T)10 LunaScript RT Master Mix (sin cebadores) (5X) Mezcla de control sin RT (sin cebadores) (5X) Agua sin nucleasas Mezcla enzimática ProtoScript II (10X) Mezcla de reacción ProtoScript II (2X) Oligo d(T)23VN (50 µM) Mezcla de cebadores aleatorios (60 µM) Agua sin nucleasas Formato Aplicación recomendada Cebadores Incubación Para detección RT-qPCR de 2 pasos Hexámero y d(T)10 incluidos 25 °C 2 min; 55 °C 10 min; 95 °C 1 min Para detección por RT-qPCR de 2 pasos Mezcla de cebadores aleatorios 25 °C 2 min; 55 °C 10 min; 95 °C 1 min Para síntesis general de ADNc d(T)23VN o cebadores específicos del gen 55 °C 10 min; 95 °C 1 min Mezcla de cebadores aleatorios 25 °C 2 min; 55 °C 10 min; 95 °C 1 min Para síntesis general de ADNc d(T)23VN o cebadores específicos del gen 42 °C 60 min; 80 °C 5 min Mezcla de cebadores aleatorios 25 °C 5 min; 42 °C 60 min; 80 °C 5 min Ventajas ✓ Supermix ✓ Protocolo corto ✓ Un indicador de seguimiento visible ✓ Temperatura de reacción más alta ✓ Mayor volumen de entrada de ARN ✓ Elección flexible de cebadores ✓ Protocolo corto ✓ Un indicador de seguimiento visible ✓ Temperatura de reacción más alta ✓ Mayor volumen de entrada de ARN ✓ Elección flexible de cebadores ✓ Todo incluido Siga el árbol de decisiones a continuación para elegir el kit de síntesis de ADNc de primera cadena en función de sus aplicaciones posteriores. Figura 1. LunaScript RT Master Mix (sin cebadores) admite numerosas aplicaciones. Al agregar diferentes cebadores, incluidos Random Primer Mix, d(T)23VN y hexámeros aleatorios, el ADNc producido por LunaScript RT Master Mix puede ser ideal para aplicaciones posteriores como la detección por RT-qPCR, RT-PCR y estudios de ARN-seq. P: Al utilizar productos de ADNc de LunaScript en la PCR posterior (es decir, RT-PCR de dos pasos), ¿qué volúmenes y productos de PCR se pueden utilizar? R: Los productos de ADNc de las reacciones de LunaScript son compatibles con muchos reactivos de PCR. Normalmente, recomendamos la mezcla maestra OneTaq 2X (NEB n.° M0482 o NEB n.° M0485) para la detección por PCR de hasta 5 kb, la mezcla maestra Q5 Hot Start High-Fidelity 2X (NEB n.° M0494) para la máxima fidelidad y la mezcla maestra LongAmp Taq 2X (NEB n.° M0287) para obtener altos rendimientos a partir de productos más largos. Dependiendo de los objetivos/cebadores, la entrada óptima de ADNc puede variar y debe optimizarse, pero normalmente recomendamos 1 μl de la reacción de ADNc como entrada en una PCR de 25 μl. Cuando sea útil, se puede añadir hasta un 20 % del volumen de PCR (p. ej., 5 μl de producto de ADNc en una PCR de 25 μl). P: ¿Puedo usar LunaScript RT SuperMix en flujos de trabajo de secuenciación de ARN? R: LunaScript RT SuperMix contiene hexámeros aleatorios y oligonucleótidos dT, lo que ofrece una cobertura uniforme de las plantillas de ARN. Se ha utilizado en la secuenciación genómica del SARS-CoV-2 siguiendo diversos protocolos, incluidos los de la red ARTIC. Hay soluciones completas disponibles en estos productos NEB: NEB n.° E7660, NEB n.° E7658 y NEB n.° E7560. P: ¿Cómo elijo entre el kit LunaScript® RT SuperMix y los kits de síntesis de ADNc de primera cadena ProtoScript? R: Los kits de síntesis de ADNc de primera cadena contienen diferentes transcriptasas inversas, cuyas principales diferencias residen en sus aplicaciones principales, formato y temperatura de reacción. A continuación, se presenta un resumen de nuestros tres kits de síntesis de ADNc de primera cadena. Producto Kit LunaScript RT SuperMix (E3010) Kit de síntesis de ADNc de primera hebra ProtoScript II (E6560) Kit de síntesis de ADNc de primera hebra ProtoScript (E6300) Transcriptasa inversa RT Luna Transcriptasa inversa ProtoScript II Transcriptasa inversa M-MuLV Formato Supermix Mezcla de reacción, mezcla de enzimas, cebador Mezcla de reacción, mezcla de enzimas, cebador Aplicación primaria RT-qPCR de dos pasos RT-PCR de punto final hasta 10 kb RT-PCR de punto final hasta 5 kb Aplicación secundaria RT-PCR de punto final hasta 3 kb RT-qPCR de dos pasos RT-qPCR de dos pasos Temperatura de reacción Hasta 65 °C (55 °C óptimo) Hasta 48 °C (42 °C óptimo) Hasta 45 °C (42 °C óptimo) Entrada de ARN 1 μg a 1 pg 1 μg a 1 pg 1 μg a 1 pg Incubación 25 °C 2 min, 55 °C 10 min, 95 °C 1 min 25 °C 5 min, 42 °C 60 min, 85 °C 5 min 25 °C 5 min, 42 °C 60 min, 85 °C 5 min Características adicionales Colorante de seguimiento azul, protocolo rápido de 13 min P: ¿Cómo elijo entre Induro Reverse Transcriptase y los diferentes productos LunaScript y ProtoScript? R: Induro Reverse Transcriptase es una RT codificada por intrones del grupo II que es útil para la síntesis de ADNc a partir de transcripciones largas, ARN con fuertes estructuras secundarias y muestras de ARN con inhibidores. Por el contrario, los reactivos LunaScript son mezclas maestras. El kit LunaScript RT Master Mix (sin cebador) (NEB n.º E3025) es adecuado para la síntesis general de ADNc. Los productos LunaScript RT SuperMix (NEB n.° E3010/M3010) están optimizados para flujos de trabajo de RT-qPCR de dos pasos donde solo se requieren productos cortos de ADNc. LunaScript RT SuperMix también se incluye en el flujo de trabajo de secuenciación ARTIC SARS-CoV-2. Esta tabla describe las aplicaciones y características de cada uno. Productos de RT retrovirales con codificación intrónica Induro™ Transcriptasa inversa (NEB n.° M0681) Kit LunaScript® RT SuperMix (NEB n.° E3010) LunaScript RT SuperMix (NEB n.° M3010) Kit LunaScript RT Master Mix (NEB n.° E3025) Kit de síntesis de ADNc de primera cadena ProtoScript® II (NEB n.° E6560) Aplicaciones Síntesis de ADNc larga Muestras de ARN impuro Aplicaciones de ARN-seq (p. ej., secuenciación directa de ARN, secuenciación de ADNc de lectura larga, secuenciación de ARNt Aplicaciones Detección por RT-qPCR en 2 pasos Flujo de trabajo de ARN-seq Aplicaciones Flujo de trabajo de ARN-seq Detección por RT-qPCR en 2 pasos Síntesis general de ADNc Detección por RT-PCR en 2 pasos Aplicaciones Síntesis general de ADNc Flujo de trabajo de ARN-seq Detección por RT-PCR en 2 pasos ✓ Protocolo corto ✓ Elección flexible de cebadores, dNTP modificados ✓ Mayor temperatura de reacción ✓ Supermix ✓ Protocolo corto ✓ Colorante de seguimiento ✓ Mayor temperatura de reacción ✓ Selección flexible de cebadores ✓ Protocolo corto ✓ Colorante de seguimiento ✓ Mayor temperatura de reacción ✓ Selección flexible de cebadores ✓ El formato del kit incluye todos los componentes necesarios. P: ¿Cómo sé si mi ARN molde es de buena calidad? R: El ARN intacto de alta pureza es esencial para la síntesis completa de ADNc. Una relación de absorbancia A260/A280 superior a 1,7 o un número RIN superior a 8 en un BioAnalyzer suele indicar ARN de alta calidad.