New England Biolabs, M3029S, Luna® Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix con UDG (sin ROX)

La Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix con UDG (sin ROX) permite la detección sensible de secuencias de ARN diana, con un rendimiento robusto en aplicaciones multiplex de hasta 5 dianas. Categorías relacionadas Luna® qPCR y RT-qPCR, PCR, qPCR y tecnologías de amplificación Aplicaciones qPCR y RT-qPCR basadas en sondas, Síntesis de ADNc Preguntas frecuentes P: ¿Cómo uso la qPCR para determinar la concentración de mi material? R: La PCR cuantitativa (qPCR) utiliza fluorescencia en tiempo real para medir la cantidad de ADN presente en cada ciclo durante una PCR. Se ha desarrollado una amplia variedad de enfoques para generar una señal fluorescente, los más comunes de los cuales utilizan sondas de hidrólisis (p. ej., TaqMan®) o un colorante de unión al ADN bicatenario (p. ej., SYBR® Green). En un punto en el que la señal de fluorescencia de la qPCR es detectable sobre la fluorescencia de fondo, se puede determinar un ciclo de cuantificación o valor Cq. Los valores de Cq se pueden utilizar para evaluar la abundancia relativa de la diana entre dos o más muestras. Alternativamente, se pueden utilizar para calcular las cantidades absolutas de la diana con referencia a una curva estándar adecuada, derivada de una serie de diluciones de ADN conocidas. Normalmente, el software del instrumento de qPCR realizará los gráficos y cálculos necesarios para las determinaciones de concentración. Como alternativa, las herramientas en línea de NEB incluyen una calculadora de qPCR, disponible en NEBiocalculator.neb.com. P: ¿Puedo configurar mi Luna® RT-qPCR a temperatura ambiente? R: Sí. Luna RT-qPCR se puede configurar a temperatura ambiente, pero para obtener mejores resultados, las reacciones deben mantenerse en hielo antes del termociclado. Ambas enzimas presentes en el kit, la ADN polimerasa Taq Hot Start y la transcriptasa inversa Luna WarmStart®, están controladas por inhibidores reversibles sensibles a la temperatura (SOMAmer®). Estos SOMAmers inhiben la actividad de la polimerasa por debajo de 45 °C, lo que previene la actividad inespecífica no deseada hasta que la reacción se calienta por encima de la temperatura de liberación durante el paso de transcripción inversa. P: ¿Debería usar detección basada en sonda o colorante para mis ensayos de qPCR? R: La detección basada en colorante (p. ej., SYBR® Green) solo requiere la adición de cebadores de PCR, lo que la convierte en una opción de qPCR rentable. Sin embargo, el colorante intercalante detectará cualquier dsADN producido en la reacción. Por lo tanto, se puede observar una amplificación fuera del objetivo y sin molde (NTC) para algunos conjuntos de cebadores, lo que resulta en una cuantificación inexacta. Las curvas de desnaturalización (fusión) realizadas después de la PCR se pueden utilizar para distinguir entre productos correctos e inespecíficos. Además, solo se puede medir un único amplicón en una qPCR basada en colorante, sin capacidad para realizar reacciones multiplex. La detección basada en sonda requiere el diseño y la obtención de un oligonucleótido sonda marcado con fluorescencia y específico de la secuencia, además de los cebadores de PCR típicos. Esto aumenta los costos del ensayo, pero los experimentos de qPCR basados ​​en sonda se benefician de una especificidad extrema y es improbable que resulten en una cuantificación inexacta debido a la amplificación por NTC. Las reacciones multiplex son posibles con sondas, ya que se pueden diseñar diferentes amplicones con fluoróforos únicos según las capacidades ópticas del instrumento de qPCR. P: ¿Cómo debo diseñar cebadores para Luna® qPCR? R: Recomendamos usar software de diseño de cebadores (p. ej., Primer3) para seleccionar las secuencias diana y de cebador con el fin de maximizar la eficiencia de la amplificación y minimizar la amplificación inespecífica y los dímeros de cebador. Luna qPCR también es compatible con los ensayos de qPCR disponibles comercialmente. Si se diseñan cebadores manualmente, se recomienda diseñar amplicones cortos (de 70 pb a 200 pb) con un contenido de GC equilibrado (40-60%). Se debe intentar alcanzar una Tm de aproximadamente 60 °C utilizando la configuración de Hot Start Taq en la calculadora de Tm de NEB (TmCalculator.neb.com). Para dianas de ADNc y ARN, se recomienda diseñar cebadores en sitios de empalme conocidos (uniones exón-exón) para evitar la amplificación a partir del ADN genómico. P: ¿Qué longitud debe tener mi amplicón para qPCR? R: Un factor importante en un experimento de qPCR es maximizar la eficiencia de la amplificación por PCR, y los amplicones de PCR cortos ayudan a garantizar una alta eficiencia. Los amplicones de qPCR típicos tienen una longitud de 70-200 pb, y recomendamos diseñar su diana en ese rango. Se pueden usar amplicones más largos, pero podrían requerir optimización (p. ej., mayores tiempos de extensión). P: ¿Por qué Luna® qPCR Mix es azul? ¿Este colorante interferirá con la detección? R: Luna qPCR Mix contiene un colorante de referencia visual inerte que le da a la mezcla un color azul claro. Esta apariencia coloreada facilita la identificación de los pocillos de una placa de qPCR que se han cargado con reactivos, lo cual puede ser difícil debido al pequeño tamaño de los pocillos y la naturaleza opaca de muchas placas de qPCR de 96 y 384 pocillos. El colorante azul se ha evaluado ampliamente en PCR y qPCR y no inhibe ni interfiere con la detección de qPCR. P: ¿Puedo utilizar la mezcla Luna® qPCR en mi instrumento de qPCR? R: Las siguientes mezclas Luna qPCR contienen un colorante de referencia pasivo universal que permite su compatibilidad con una amplia variedad de instrumentos en tiempo real, incluyendo aquellos que no utilizan colorante de normalización de referencia pasivo (p. ej., Bio-Rad® CFX), una referencia pasiva de baja concentración (p. ej., Applied Biosystems® 7500 o QuantStudio®) o una referencia pasiva de alta concentración (p. ej., Applied Biosystems 7900 o StepOne®). Luna Universal qPCR Master Mix (NEB #M3003) Luna Universal Probe qPCR Master Mix (NEB #M3004) Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit (NEB #E3005) Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit (NEB #E3006) Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix con UDG (NEB #M3019) LyoPrime Luna Probe One-Step RT-qPCR Mix con UDG (NEB #L4001) El Luna Probe One-Step RT-qPCR Kit (sin ROX) (NEB #E3007) y Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix con UDG (sin ROX) (NEB #M3029) carecen de un colorante de referencia y se pueden usar con cualquier instrumento que no requiera normalización ROX. Consulte las instrucciones del fabricante del instrumento para obtener más detalles. Además, Luna Mix se puede usar con condiciones de ciclado estándar o rápido. P: ¿Puedo usar configuraciones rápidas del instrumento con Luna® qPCR Mix? R: Luna qPCR Mix es compatible con velocidades de rampa rápidas y estándar en instrumentos que ofrecen ambas. Recomendamos temperaturas y tiempos de ciclado específicos (consulte el protocolo o el manual para obtener más información), pero cualquiera de las configuraciones de rampa se puede usar con estas condiciones de ciclado. (Nota: las condiciones de ciclado deben verificarse después de cambiar la configuración de la velocidad de rampa; en ciertos instrumentos de tiempo real, cambiar la velocidad de rampa también revertirá las condiciones de ciclado a la configuración predeterminada del instrumento). P: ¿Necesito agregar ROX? R: Algunos instrumentos de tiempo real recomiendan el uso de un colorante de referencia pasivo (normalmente ROX) para compensar las variaciones entre pocillos que podrían deberse a limitaciones de la máquina, como el "efecto de borde", burbujas, pequeñas diferencias de volumen y autofluorescencia del polvo o partículas en la reacción. Sin embargo, la normalización de ROX tiene poco efecto sobre las variaciones causadas por errores de pipeteo de plantillas/cebadores, mezcla heterogénea y problemas de evaporación/condensación. Los siguientes productos Luna® qPCR contienen un colorante de referencia pasivo universal que permite la compatibilidad con una variedad de instrumentos en tiempo real, incluidos aquellos que no utilizan normalización de referencia pasiva y aquellos que utilizan una cantidad baja o alta de colorante de referencia pasivo (ROX). Luna Universal qPCR Master Mix (NEB #M3003) Luna Universal Probe qPCR Master Mix (NEB #M3004) Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit (NEB #E3005) Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit (NEB #E3006) Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix con UDG (NEB #M3019) LyoPrime Luna Probe One-Step RT-qPCR Mix con UDG (NEB #L4001) El Luna Probe One-Step RT-qPCR Kit (sin ROX) (NEB #E3007) y Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix con UDG (sin ROX) (NEB #M3029) carecen de un colorante de referencia y se pueden usar con cualquier instrumento que no requiera normalización ROX. Consulte las instrucciones del fabricante del instrumento para obtener más detalles. Instrumento qPCR ROX Bio-Rad® iQ™5, CFX96, CFX384, Opticon Roche Lightcycler® Qiagen Rotor-Gene™ Eppendorf Mastercycler® Cepheid® SmartCycler® No recomendado/obligatorio Applied Biosystems® 7500, 7500 Fast, QuantStudio™, ViiA7™ Agilent Mx™ Low ROX (~50 nM final) Applied Biosystems® 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900HT Fast, StepOne™, StepOnePlus™ High ROX (~500 nM final) P: ¿Qué muestras de ARN se pueden usar en RT-qPCR con Luna® Mix? R: Para obtener los mejores resultados, recomendamos una extracción o purificación del material de partida de ARN. El kit Luna RT-qPCR funciona con ácidos nucleicos de una variedad de tipos de muestras purificadas mediante métodos típicos basados ​​en columnas (p. ej., el kit Monarch® RNA Miniprep (NEB n.º T2010)). Al realizar estudios con cultivos de células de mamíferos, los lisados ​​celulares generados por el módulo de lisis Luna Cell Ready (NEB n.º E3032) se pueden agregar a todos los reactivos Luna One-Step RT-qPCR. Además, numerosos estudios han demostrado directamente la compatibilidad de los reactivos Luna con saliva y otras muestras clínicamente relevantes mediante protocolos de preparación de muestras crudas. SalivaDirect es un ejemplo. P: ¿Cuánto cebador y sonda debo usar con el kit Luna® Universal Probe RT-qPCR? R: Para la mayoría de los objetivos, una concentración final de 400 nM para cada cebador y 200 nM para la sonda proporcionará un rendimiento óptimo. Si es necesario, la concentración final del cebador se puede optimizar entre 100 y 900 nM y la concentración final de la sonda se puede optimizar entre 100 y 500 nM. P: ¿Puedo usar tiempos de ciclado más cortos? R: Sí. Para muchos objetivos, se pueden usar tiempos de incubación más cortos en cada paso. Sin embargo, se recomiendan condiciones de ciclado estándar como punto de partida y pueden ser necesarias para ensayos complejos, como aquellos con bajo aporte de ADN. P: ¿Cuánta plantilla de ARN debo usar en mi reacción de RT-qPCR? R: El kit Luna® Universal One-Step RT-qPCR funciona bien con plantillas de ARN purificadas, incluyendo ARN total, ARNm y muestras de transcripciones in vitro. Cantidad en 20 μl de reacción: ARN total ≤ 1 μg; poli(A)-ARN ≤ 0,1 μg; transcripciones in vitro ≤ 10⌃9 copias. P: ¿Puedo realizar reacciones multiplex con los kits Luna® Probe One-Step RT-qPCR? ¿Necesito cambiar las condiciones de mi reacción? R: Sí, se han realizado con éxito reacciones multiplex que amplifican hasta 5 objetivos utilizando los kits Luna Universal Probe RT-qPCR. Seleccione los diferentes fluoróforos correspondientes a los distintos canales de detección del instrumento en tiempo real. Cada diana debe analizarse primero en una reacción singleplex. Para cada amplicón, comience añadiendo 400 nM de cebador directo e inverso y 200 nM de sonda en cada reacción. Si se observa un deterioro en el rendimiento de un amplicón en particular al utilizarlo en un ensayo multiplex en comparación con sus resultados singleplex, es posible que sea necesario optimizar las reacciones. Puede ser útil reducir las concentraciones de cebador para una diana abundante o con un alto número de copias, o aumentarlas para las dianas de baja abundancia o con un bajo número de copias. Es posible que se requiera una mayor optimización a medida que aumenta la multiplexación, utilizando como guía los siguientes parámetros: cebador 100-900 nM, sonda 100-500 nM. Ejemplo de una reacción 3-plex con el kit de sondas Luna Universal One-Step RT-qPCR en un instrumento Applied Biosystems™ 7500 Fast: P: ¿Puedo usar una sonda marcada con ROX con las mezclas de sondas Luna® que contienen un colorante de referencia universal ROX? R: Sí. Sin embargo, deben tenerse en cuenta los requisitos de normalización de referencia pasiva del instrumento en tiempo real. En instrumentos que no utilizan normalización con ROX, generalmente se puede usar una sonda ROX sin problemas ni modificaciones. En instrumentos que utilizan ROX para la normalización, no se recomiendan las sondas ROX, ya que esta opción no está disponible en la configuración típica del instrumento. Es posible usar sondas ROX siempre que la normalización con ROX esté desactivada, pero se perderán sus beneficios. Si prefiere una mezcla sin ROX, consulte el kit Luna Probe One-Step RT-qPCR (sin ROX) (NEB n.° E3007) o la mezcla Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X con UDG (sin ROX) (NEB n.° M3029), o escriba a info@neb.com. P: ¿Se pueden utilizar estrategias de detección alternativas basadas en sondas con la mezcla de sondas Luna®? R: Sí. Molecular beacon y Scorpions® se han probado con éxito con las mezclas de sondas Luna. También deberían ser posibles otros diseños de sonda, siempre que sean compatibles con la actividad endo del flap 5'→3' de la ADN polimerasa Hot Start Taq. P: ¿Qué temperatura debo utilizar para la síntesis de ADNc con los kits Luna® RT-qPCR? R: La transcriptasa inversa termoestable Luna WarmStart® permite una síntesis eficiente de ADNc a temperaturas elevadas en comparación con MMLV. En general, la síntesis de ADNc se puede lograr con una incubación de 10 minutos a 55 °C. Para moldes difíciles, la temperatura de síntesis de ADNc se puede aumentar a 60 °C. P: ¿Puedo usar dianas más largas en la RT-qPCR de un solo paso? R: En general, los amplicones más pequeños (70 pb-200 pb) tienden a resultar en mayores eficiencias y Cqs más tempranos. Para dianas en este rango de tamaño, se recomienda un tiempo de extensión de 30 segundos. Las dianas más largas se beneficiarán de tiempos de extensión más largos, pero el tiempo real dependerá de la longitud de la diana y del tipo de instrumento, y debe determinarse empíricamente. P: ¿Es el kit Monarch® Total RNA Miniprep compatible con los reactivos Luna® RT-qPCR? R: Sí. El ARN purificado con estos kits se puede usar para RT-qPCR con todos los kits Luna One-Step RT-qPCR de NEB y los productos LunaScript® RT. La RT-qPCR de ARN purificado por Monarch de varios tipos de muestra produce resultados de alta calidad de manera consistente, lo que permite una cuantificación precisa y reproducible Para demostrar la calidad y utilidad del ARN total de Monarch para la cuantificación basada en RT-qPCR, se realizaron y visualizaron 16 experimentos utilizando el enfoque de "puntos en cajas" desarrollado en NEB. Cada experimento abarca reacciones por triplicado para un rango de cinco logaritmos de concentraciones de plantilla de entrada y controles sin plantilla (NTC) (18 reacciones en total). Un experimento de RT-qPCR de alta calidad, representado por un punto dentro de la caja, se define como aquel que tiene una eficiencia entre el 90-110%, un ΔCq de ≥3 (donde ΔCq es la diferencia entre el Cq promedio del NTC y la entrada más baja) y un Nivel de calidad ≥4 (basado en linealidad, reproducibilidad, forma de la curva y otros parámetros). Se utilizaron cebadores dirigidos a las variantes de GAPDH (rata, ratón, tomate, levadura), variantes de PGK (rata) y variantes de B-actina (rata, ratón, tomate) con ARN total purificado de cerebro de rata, hígado de rata, riñón de rata, riñón de ratón, hoja de tomate y levadura como plantillas. Los ensayos de RT-qPCR se ensamblaron según las instrucciones utilizando reactivos Luna RT-qPCR y se cicló en un Bio-Rad CFX384. La RT-qPCR en ARN purificado con Monarch genera curvas de qPCR de alta calidad que demuestran una cuantificación precisa en una amplia variedad de tipos de muestras. El ARN purificado con Monarch de sangre completa humana, riñón de rata, hoja de tomate y la levadura S. cerevisiae se diluyó para producir un rango de cinco logaritmos de concentraciones de plantilla de entrada. Se utilizaron cebadores dirigidos a las variantes de GAPDH (tomate, levadura), PGK (rata) o SMG1 (sangre humana) para los ensayos de RT-qPCR. Se ensamblaron según las instrucciones con reactivos Luna RT-qPCR (NEB n.° E3005) y se cicló en un Bio-Rad CFX384. P: ¿Son compatibles los kits de limpieza de ARN Monarch Spin con los reactivos Luna RT-qPCR? R: Sí. El ARN purificado con estos kits se puede utilizar para RT-qPCR con todos los kits Luna One-Step RT-qPCR de NEB y los productos LunaScript® RT. P: ¿Cuáles son las diferencias entre los productos Luna One-Step RT-qPCR (NEB n.° E3006, E3007, M3019, M3029 y L4001)? R: Todos estos productos Luna están optimizados para la RT-qPCR de un solo paso mediante detección de sonda. NEB #M3019/#M0329 son mezclas maestras 4X de un solo tubo. Los productos NEB #E3006/#E3007 contienen tubos separados para la mezcla de reacción 2X y la mezcla enzimática 20X. Además, el producto M3019 incluye no solo dUTP, sino también un UDG termolábil para prevenir el arrastre. NEB #L4001 es una versión liofilizada de NEB#M3019 y está disponible en viales o placas de 96 pocillos. NEB #E3007 y #M3029 carecen de un colorante de referencia pasivo ROX universal. Las mezclas disponibles difieren en cuanto a formato, temperatura de almacenamiento e inclusión de UDG termolábil para prevenir el arrastre, como se describe en la tabla a continuación. NEB #M3019 Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix con UDG NEB #M3029 Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix con UDG (sin ROX) NEB #E3006 Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit NEB #E3007 Luna Probe One-Step RT-qPCR Kit (sin ROX) NEB #L4001 LyoPrime Luna Probe One-Step RT-qPCR Mix con formato UDG Mezcla maestra 4X Mezcla maestra 4X Mezcla de reacción 2X Mezcla de enzimas 20X Mezcla de reacción 2X Mezcla de enzimas 20X Mezcla maestra liofilizada; rehidratar a 2-4X Prevención de arrastre incluida Y (dUTP y UDG termolábil incluidos) Y {dUTP y UDG termolábil incluidos) N (dUTP incluido; requiere adición de UDG) N (dUTP incluido; requiere adición de UDG) Y (dUTP y UDG termolábil incluidos) Colorante de normalización (ROX universal) YNYNY Multiplexación Y (hasta 5-plex) Y (hasta 5-plex) Y (hasta 5-plex) Y (hasta 5-plex) Y (hasta 5-plex) Volumen máximo de muestra (reacción RT-qPCR de 20 µl) hasta 10 µl hasta 10 µl hasta 8 µl hasta 8 µl hasta 10 µl Condición de ciclado estándar 25 °C durante 30 s (tratamiento con UDG); 55 °C durante 10 min; 95 °C durante 1 min; 45 ciclos de 95 °C durante 10 s, 60 °C durante 30 s, 25 °C durante 30 s (tratamiento UDG); 55 °C durante 10 min; 95 °C durante 1 min; 45 ciclos de 95 °C durante 10 s, 60 °C durante 30 s, 55 °C durante 10 min; 95 °C durante 1 min; 45 ciclos de 95 °C durante 10 s, 60 °C durante 30 s, 55 °C durante 10 min; 95 °C durante 1 min; 45 ciclos de 95 °C durante 10 s, 60 °C durante 30 s, 25 °C durante 30 s (tratamiento UDG); 55 °C durante 10 min; 95 °C durante 1 min; 45 ciclos de 95 °C durante 10 s, 60 °C durante 30 s. Temperatura de almacenamiento: -20 °C -20 °C -20 °C -20 °C Temperatura ambiente (15 °C a 25 °C). P: Otras empresas recomiendan una incubación de 2 min a 25 °C para prevenir el arrastre. ¿Es suficiente una incubación de 30 s a 25 °C? R: Sí, dada la robusta actividad del UDG termolábil de NEB, observamos la degradación de hasta aproximadamente 100 000 copias de entrada de contaminación simulada utilizando un paso de incubación de 30 s a 25 °C. Dado que la contaminación por arrastre suele implicar cantidades de entrada mucho menores, no es necesario extender la incubación. P: ¿Cómo puedo realizar un control sin RT? R: Para configurar los controles sin RT, tome una alícuota de M3019 e incube a 95 °C durante 5 minutos. Este paso inactivará la transcriptasa inversa Luna WarmStart y el UDG termolábil. Luego, use el M3019 tratado para configurar las reacciones de control sin RT y realice las mismas condiciones de ciclado que las otras muestras. Los valores positivos de Cq superiores a 40 indican una posible contaminación del ADN. P: ¿Puedo usar las mezclas Luna Probe RT-qPCR para la detección viral? R: Sí, las mezclas Luna Probe RT-qPCR son especialmente adecuadas para permitir la detección sensible de dianas virales, incluida la detección del virus SARS-CoV-2. Puede encontrar ejemplos de cómo las personas han usado Luna y otros productos en nuestra página de investigación de COVID-19.