New England Biolabs, M5508L, enzima termolábil USER® II

También está disponible una versión termoestable, la enzima termoestable USER III ( Categorías relacionadas Enzimas de reparación de ADN y endonucleasas específicas de la estructura Aplicaciones Aplicaciones de las enzimas USER® y USER II termolábiles, USER, ®, Clonación, Ensamblaje y clonación de ADN, Especificación Definición de la unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para cortar 10 pmol de un dúplex de oligonucleótidos de 34 mer marcado con fluorescencia que contiene una sola base de uracilo en 15 minutos a 37 °C en un volumen de reacción total de 10 μl en tampón de ligasa de ADN T4 1X. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ 50 mM Acetato de potasio 20 mM Tris-acetato 10 mM Acetato de magnesio 100 µg/ml Albúmina recombinante (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en tampones NE. Tampón de almacenamiento: Tris-HCl 15 mM, NaCl 35 mM, KCl 25 mM, DTT 1 mM, EDTA 0,1 mM, BSA 100 µg/ml, glicerol al 50 %, pH 7,5 a 25 °C. Inactivación térmica: 65 °C durante 10 minutos. Preguntas frecuentes : P: ¿Cuál es la actividad de la enzima termolábil USER II en otros tampones? R: La enzima termolábil USER II es 100 % activa en diversos tampones, como el tampón rCutSmart (NEB n.° B6004), el tampón NE r1.1, el tampón de reacción de la ligasa de ADN T4 (NEB n.° B0202) y el tampón TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 0,1 mM). La actividad en los tampones NE es la siguiente: Tampón NE r1.1, r2.1 r3.1 rCutSmart™ % Actividad 100 100 100 100 Además, la enzima termolábil USER II es 100 % activa en muchos tampones de polimerasa y PCR (véase la tabla a continuación). Tampón % Actividad Tampón de reacción Thermopol (NEB n.° B9004) 100 % Tampón de reacción Q5® (NEB n.° B9027) 100 % Tampón Phusion™ HF (NEB n.° B0518) 100 % Tampón PCR (Roche) 100 % Tampón GoTaq® (Promega®) 100 % Tampón PCR (Qiagen®) 100 % Tampón Pfu Turbo Cx (Agilent Technologies) 100 % Tampón AmpliTaq Gold® 360 (ThermoFisher®) 100 % Tampón PCR Fast Start™ Taq DNA Pol (Sigma Aldrich) 100 % PCR Tampón (Applied Biosystems) 100 % Tampón PCR (Enzymatics) 100 % AmpliTaq Gold®, Phusion® y Thermo Fisher® son marcas registradas y propiedad de Thermo Fisher Scientific. s.GoTaq® y Promega® son marcas registradas de Promega, Inc. Qiagen® es una marca registrada de Qiagen, Inc. Fast Start™ es una marca registrada de Sigma Aldrich. P: ¿Se puede inactivar térmicamente la enzima USER termolábil? R: Sí, a diferencia de la enzima USER (NEB n.° M5505), que no se puede inactivar térmicamente y debe eliminarse mediante otros métodos (p. ej., purificación en columna/extracción con fenol y cloroformo), la enzima USER termolábil se puede inactivar térmicamente a 65 °C durante 10 min. P: ¿En qué se diferencia la enzima USER® II termolábil de la enzima USER? R: La enzima USER II termolábil es similar a la enzima USER (escisión específica de uracilo) Reactivo) Enzima (NEB #M5505), ya que ambas generarán un único nucleótido en la ubicación de un uracilo, con la ventaja adicional de ser completamente inactivadas por calor a 65 °C. La actividad liasa de la Endonucleasa VIII en la Enzima USER rompe la cadena principal fosfodiéster y deja un fosfato 3' y 5', mientras que la actividad liasa de la Endonucleasa III en la Enzima USER II Termolábil rompe la cadena principal fosfodiéster y deja un aldehído 3'-fosfo-α, β-insaturado y un fosfato 5'. P: ¿La Enzima USER II Termolábil (NEB #M5508) eliminará el uracilo del ADNmc y el ADNdc? R: La Enzima USER II Termolábil eliminará el uracilo tanto del ADNmc como del ADNdc; sin embargo, la Enzima USER II Termolábil tiene una actividad aproximadamente tres veces menor en ADNmc en comparación con ADNdc. La enzima termolábil USER II no tiene actividad sobre nucleótidos (dUTP) en solución. P: ¿Para qué aplicaciones es más adecuada la enzima termolábil USER® II? R: La enzima termolábil USER II se puede utilizar en muchas aplicaciones que actualmente emplean la enzima USER (NEB n.° M5505), como la clonación USER, la escisión de adaptadores NEBNext® durante la preparación de la biblioteca NGS y la eliminación selectiva de la segunda cadena que contiene dU durante el flujo de trabajo de secuenciación de ARN direccional NEBNext. Para más información, visite Aplicaciones de las enzimas User y USER II termolábiles. P: Durante la preparación de una biblioteca de ADN NEBNext, ¿qué enzima escinde los adaptadores de bucle de ADN NEBNext y los bucles monocatenarios que contienen uracilo? R: La enzima USER se elabora a partir de UDG y endonucleasa VIII. El UDG ayuda a crear un espacio en el sitio del uracilo y la endonucleasa VIII. Se dirige a ese sitio y escinde la cadena principal de fosfodiéster en los extremos 3' y 5', liberando desoxirribosa sin bases. P: ¿Puede contarme más sobre el cambio de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NEB? R: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) a tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de cambiar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan rAlbúmina. Creemos que dejar de usar productos de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio. P: ¿Cuál es la diferencia entre el conjunto de enzimas USER® (#M5505, #M5508, #M5509) y la endonucleasa termoestable Q (#M0701)? R: Los productos USER (enzima USER (#M5505), enzima termolábil USER II (#M5508) y enzima termoestable USER III (#M5509) son una mezcla de dos enzimas: UDG y una endonucleasa. Por el contrario, la endonucleasa termoestable Q (#M0701) es una sola enzima. Aunque las enzimas USER y la endonucleasa termoestable Q reconocen y escinden el desoxiuracilo en los sustratos de ADN, los productos resultantes son diferentes. Los productos finales de las enzimas USER son huecos de un nucleótido con extremos funcionales variables según el tipo de USER implementado; se elimina el desoxiuracilo. Los productos de la endonucleasa termoestable Q son mellas con un 3'-OH y un 5'-fosfato; el desoxiuracilo todavía está presente en el segmento 3' de ADN. P: ¿Alguna de las enzimas USER deja extremos ligables al escindir un uracilo? R: No, ni la enzima USER (NEB #M5505), la enzima termolábil USER II (NEB #M5508) ni la enzima termoestable USER III (NEB #M5509) dejan extremos ligables al escindir un uracilo. Sin embargo, la endonucleasa termoestable Q (NEB #M0701) corta el extremo 5' de un uracilo (dejando la nucleobase intacta), pero deja extremos ligables 3' OH y 5' P tras la escisión. P: ¿A qué distancia de los extremos del ADN puede escindir la enzima termolábil USER II (NEB #M5508)? R: La enzima termolábil USER® II escinde un desoxiuracilo a tan solo 3 pares de bases del extremo 5' de la doble cadena o al menos 12 Nucleótidos del extremo 5' del ADN monocatenario. La enzima termolábil USER II escinde un desoxiuracilo a tan solo 3 pares de bases del extremo 5' del ADN bicatenario o al menos 6 nucleótidos del extremo 3' del ADN monocatenario. Para más información, consulte "Escisión del desoxiuracilo cerca de los extremos del ADN bicatenario y el ADN monocatenario".