New England Biolabs, M5509S, enzima termoestable USER® III

La enzima termoestable USER (reactivo de escisión específico para uracilo) III genera un único nucleótido en la ubicación de un residuo de uracilo. Es activa entre 50 y 75 °C (actividad óptima observada a 65 °C). Categorías relacionadas : Enzimas reparadoras de ADN y endonucleasas de estructura específica. Aplicaciones: Ensamblaje y clonación de ADN, Soluciones de clonación y automatización de alto rendimiento. Especificación: Unidad. Definición: Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para cortar 10 pmol de un dúplex de oligonucleótidos de 60 mer marcado con fluorescencia que contiene una única base de uracilo, en 15 minutos a 65 °C en un volumen total de reacción de 10 μl en tampón Thermopol 1X. Condiciones de reacción 1X ThermoPol® Reaction Buffer Incubar a 65 °C 1X ThermoPol® Reaction Buffer 20 mM Tris-HCl 10 mM (NH4)2SO4 10 mM KCl 2 mM MgSO4 0,1 % Triton® X-100 (pH 8,8 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 15 mM Tris-HCl 35 mM NaCl 1 mM DTT 0,1 mM 100 µg/ml BSA 50 % Glicerol pH 7,4 a 25 °C Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la actividad de la enzima termoestable USER® III en otras soluciones tampón? R: La enzima termoestable USER III es 100 % activa en el tampón Thermopol y tiene una actividad limitada en otras soluciones tampón. La actividad en NEBuffers a 65 °C es la siguiente: NEBuffer r1.1 r2.1 r3.1 rCutSmart™ % Actividad 100 50 50 75 Además, la enzima termolábil USER II es 100 % activa en muchos tampones de polimerasa y PCR (consulte el cuadro a continuación). Actividad del tampón (relativa al tampón Thermopol) Tampón de reacción Thermopol II (NEB n.º B9004) 100 % Tampón de reacción Q5® (NEB n.º B9027) 50 % Tampón GoTaq® Flexi incoloro (Promega®) 75 % Tampón PCR (Qiagen®) 75 % Tampón iTaq 100 % Tampón AmpliTaq Gold® 360 (ThermoFisher®) 100 % Tampón PCR Fast Start™ Taq DNA Pol (Sigma Aldrich) 0 % Tampón Ex Taq (Takara) 0 % Tampón Dream Taq (ThermoFisher®) 75 % Tampón PCR Platinum II (Invitrogen) 75 % AmpliTaq Gold® y Thermo Fisher® son marcas comerciales registradas y propiedad de Thermo Fisher Scientific. GoTaq® y Promega® son marcas registradas de Promega, Inc. Qiagen® es una marca registrada de Qiagen, Inc. Fast Start™ es una marca registrada de Sigma Aldrich. P: ¿A qué temperatura es activa la enzima termoestable USER® III? R: La enzima termoestable USER III es activa a temperaturas >50 °C, con una actividad óptima observada a 65 °C. Se observa una actividad mínima a temperaturas inferiores a 50 °C. Al igual que la enzima USER (NEB n.° M5505), la enzima termoestable USER III no se puede inactivar por calor y debe eliminarse mediante otros métodos (p. ej., purificación en columna/extracción con fenol y cloroformo). P: ¿En qué se diferencia la enzima termoestable USER® III de la enzima USER y la enzima termolábil USER II? R: La enzima termoestable USER III es similar a la enzima USER (reactivo de escisión específico para uracilo) (NEB n.° M5505) y a la enzima termolábil USER II (NEB n.° M5508), ya que las tres generan un único nucleótido en la ubicación de un uracilo. La enzima termolábil USER II tiene la ventaja adicional de ser inactivable por calor (65 °C durante 10 minutos), mientras que la enzima termoestable USER III es activa a temperaturas más altas (>50 °C). La USER II termolábil puede inactivarse por calor, mientras que la enzima USER y la enzima termoestable USER III deben eliminarse de la reacción por otros medios (limpieza de la columna u otros métodos de purificación). Todas las enzimas USER romperán la cadena principal fosfodiéster pero dejarán diferentes extremos 3' y 5': la actividad liasa de la endonucleasa VIII en la enzima USER deja un fosfato 3' y 5', la actividad liasa de la endonucleasa III en la enzima USER II termolábil deja un aldehído 3'-fosfo-α, β-insaturado y 5' fosfato y la actividad liasa de la endonucleasa IV en la enzima USER III termoestable deja un fosfato 3'-hidroxilo y 5'-desoxirribosa. La enzima USER (NEB #M5505), la enzima USER II termolábil (NEB #M5508) y la enzima USER III termoestable (NEB #M5509) generan diferentes extremos funcionales después de la escisión del ADN. Además de las diferentes temperaturas óptimas de reacción (37 °C para USER y la enzima termolábil USER II y 65 °C para la enzima termoestable USER III) y la capacidad de inactivarse por calor (solo la enzima termolábil USER II), las diferentes enzimas USER generan diferentes extremos 3' y 5' después de la escisión. La enzima USER (NEB #M5505) contiene endonucleasa VIII y deja un fosfato 3' y 5' después de la escisión. La enzima termolábil USER II (NEB #M5508) contiene endonucleasa III y deja un aldehído 3'-fosfo-α, β-insaturado y un fosfato 5' después de la escisión. La enzima termoestable USER III (NEB #M5509) contiene endonucleasa IV y deja un fosfato 3'-hidroxilo y 5'-desoxirribosa. P: ¿La enzima termoestable USER® III elimina el uracilo del ADNmc y dsADN? R: La enzima termoestable USER III elimina el uracilo del ADNmc con la misma eficacia que del ADNdc. La enzima termoestable USER III no tiene actividad sobre nucleótidos (dUTP) en solución. P: ¿Cuál es la diferencia entre el conjunto de enzimas USER® (#M5505, #M5508, #M5509) y la endonucleasa termoestable Q (#M0701)? A: Los productos USER (enzima USER (#M5505), enzima termolábil USER II (#M5508) y enzima termoestable USER III (#M5509) son una mezcla de dos enzimas: UDG y una endonucleasa. Por el contrario, la endonucleasa termoestable Q (#M0701) es una sola enzima. Aunque las enzimas USER y la endonucleasa termoestable Q reconocen y escinden en el desoxiuracilo en los sustratos de ADN, los productos resultantes son diferentes. Los productos finales de las enzimas USER son huecos de un nucleótido con extremos funcionales variables según el tipo de USER implementado; se elimina el desoxiuracilo. Los productos de la endonucleasa termoestable Q son mellas con un 3'-OH y un 5'-fosfato; el desoxiuracilo todavía está presente en el segmento 3' del ADN. P: ¿Alguna de las enzimas USER deja extremos ligables al escindir en un ¿Uracilo? R: No, ni la enzima USER (NEB #M5505), ni la enzima termolábil USER II (NEB #M5508) ni la enzima termoestable USER III (NEB #M5509) dejan extremos ligables al escindir un uracilo. Sin embargo, la endonucleasa termoestable Q (NEB #M0701) corta el extremo 5' del uracilo (dejando la nucleobase intacta), pero deja extremos ligables 3' OH y 5' P tras la escisión. P: ¿A qué distancia de los extremos del ADN puede escindir la enzima termoestable USER III (NEB #M5509)? R: La enzima termoestable USER® III escinde un desoxiuracilo a tan solo 3 pares de bases del extremo 5' del ADN bicatenario o al menos 12 nucleótidos del extremo 5' del ADN monocatenario. USER III termoestable La enzima escinde 3 pares de bases o nucleótidos de desoxiuracilo del extremo 3' del ADN, ya sea bicatenario o monocatenario. Para más información, consulte "Escisión del desoxiuracilo cerca de los extremos del dsADN y el ssADN".